CRISPR तीसरी पीढ़ी की जीनोम संपादन तकनीक है: CRISPR ने दुनिया में क्रांति ला दी।

क्लस्टर्ड रेगुलरली इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स (CRISPR) तीसरी पीढ़ी की जीनोम एडिटिंग तकनीक है जिसने अपने उच्च-थ्रूपुट परिणामों से दुनिया में क्रांति ला दी है। इसका उपयोग विभिन्न जैविक रोगों और संक्रमणों के उपचार में किया जाता रहा है। विभिन्न जीवाणुओं और अन्य प्रोकैरियोट्स (जैसे आर्किया) में भी फ़ेज से बचाव के लिए CRISPR/Cas9 प्रणालियाँ पाई जाती हैं। यह बताया गया है कि CRISPR/Cas9-आधारित रणनीतियाँ संभावित रूप से परिवर्तित प्रतिरोध जीन, प्रतिलेखन और एपिजेनेटिक विनियमन को लक्षित करके ट्रिपल नेगेटिव ब्रेस्ट कैंसर (TNBC) के विकास और प्रगति को रोक सकती हैं। ये चिकित्सीय हस्तक्षेप TNBC में भी देखी जाने वाली दवा प्रतिरोधकता जैसी चुनौतीपूर्ण समस्याओं को दूर करने में सहायक हो सकते हैं। वर्तमान में, CRISPR/Cas9 को लक्षित कोशिकाओं तक पहुँचाने के लिए विभिन्न विधियों का उपयोग किया जाता है, जैसे भौतिक (माइक्रोइंजेक्शन, इलेक्ट्रोपोरेशन और हाइड्रोडायनामिक विधियाँ), वायरल (एडेनो-एसोसिएटेड वायरस और लेंटिविरस) और गैर-वायरल (लिपोसोम और लिपिड नैनोकण)। हालांकि टीएनबीसी के आणविक कारणों का अध्ययन करने के लिए विभिन्न मॉडल विकसित किए गए हैं, लेकिन जीवित शरीर में जीनोम संपादन उपकरणों को पहुंचाने के लिए संवेदनशील और लक्षित विधियों की कमी उनके नैदानिक ​​अनुप्रयोग को सीमित करती है। संक्षेप में, यह समीक्षा मौजूदा साक्ष्यों के आधार पर टीएनबीसी के लिए CRISPR/Cas9 उपचार की प्रगति, चुनौतियों, सीमाओं और संभावनाओं का व्यापक रूप से विश्लेषण करती है। हम यह भी बताते हैं कि कृत्रिम बुद्धिमत्ता और मशीन लर्निंग का संयोजन टीएनबीसी के उपचार में CRISPR/Cas9 रणनीतियों को कैसे बेहतर बना सकता है।
कैंसर अनियंत्रित कोशिका विभाजन, कोशिका चक्र नियंत्रण बिंदुओं में व्यवधान और ट्यूमर सप्रेसर जीन (टीएसजी) में उत्परिवर्तन द्वारा पहचाना जाता है (मैथ्यूज एट अल., 2022)। विभिन्न प्रकार के कैंसर में, स्तन कैंसर महिलाओं में सबसे आम प्रकार का कैंसर है और विश्व स्तर पर इसकी मृत्यु दर बहुत अधिक है (वैक्स और विनर, 2019)। स्तन कैंसर एक विषम रोग है जिसमें ऊतकीय और जैविक विशेषताओं, नैदानिक ​​प्रस्तुति और व्यवहार, और उपचार के प्रति प्रतिक्रिया जैसी विविध विशेषताएं पाई जाती हैं (वीगेल्ट एट अल., 2010)। स्तन कैंसर का वर्गीकरण स्तन कैंसर के निदान और ट्यूमर के पूर्वानुमान के लिए सटीक जानकारी प्रदान करता है। सामान्य बायोमार्कर और नैदानिक-रोग संबंधी विशेषताओं का उपयोग स्तन कैंसर के वर्गीकरण का मुख्य मानदंड रहा है (त्सांग और त्से, 2019)। स्तन कैंसर के निदान और उपचार के प्रति प्रतिक्रिया कई कारकों से प्रभावित होती है, जिनमें एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ER), प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर (PR), ह्यूमन एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2 (HER2/neu) की उपस्थिति, ऊतकीय ग्रेड, ट्यूमर का प्रकार, आकार और लिम्फ नोड मेटास्टेसिस शामिल हैं (अल-तुबैती, 2020)। स्तन कैंसर के पाँच आंतरिक आणविक उपप्रकारों की पहचान की गई है, जिनमें ल्यूमिनल A, ल्यूमिनल B, HER2-समृद्ध, बेसल-जैसे और क्लॉडिन-कम शामिल हैं (प्रैट एट अल., 2015)। TNBC कैंसर का एक आणविक उपप्रकार है जो सभी ER, PR और HER2 को व्यक्त नहीं करता है (यिन एट अल., 2020)। ये रोग संबंधी विशेषताएं TNBC से जुड़ी हैं, जो इसकी तीव्र प्रगति और अन्य प्रकार के स्तन कैंसर की तुलना में अधिक आक्रामक प्रकृति की पुष्टि करती हैं (फेंग एट अल., 2018)। इसके अतिरिक्त, पेरू एट अल (2000) ने स्तन कैंसर को पुनर्वर्गीकृत करने और स्तन कैंसर के पांच आंतरिक उपप्रकारों की पहचान करने के लिए माइक्रोएरे तकनीक का उपयोग किया (कैडेनास, 2012)। बेसल-लाइक स्तन कैंसर, स्तन कैंसर का एक उपप्रकार है जिसमें ट्रिपल-नेगेटिव फेनोटाइप होता है और यह तेजी से बढ़ने से जुड़ा होता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सभी बेसल-लाइक स्तन कैंसर को आमतौर पर टीएनबीसी के रूप में गलत निदान किया जाता है, लेकिन केवल 77% ही टीएनबीसी होते हैं; इसके विपरीत, 71-91% टीएनबीसी बेसल-लाइक होते हैं, जो दर्शाता है कि स्तन कैंसर के ये दो प्रकार ओवरलैप करते हैं और विभिन्न वर्गीकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं (वांग डी.-वाई. एट अल., 2019)। इससे टीएनबीसी की विषमता को चिह्नित करने की आवश्यकता उत्पन्न होती है ताकि रोग का पूर्वानुमान स्पष्ट किया जा सके और वर्तमान और भविष्य के उपचारों के संभावित प्रतिसाद की पहचान की जा सके। इसके अतिरिक्त, टीएनबीसी सभी स्तन कैंसर के मामलों का 15-20% हिस्सा है और 50 वर्ष से कम उम्र की महिलाओं में अधिक आम है। लगभग 20% टीएनबीसी मामलों में बीआरसीए1 या बीआरसीए2 उत्परिवर्तन पाए गए हैं (ज़ि एट अल., 2017; त्ज़िकास एट अल., 2017, 2020)। अध्ययनों से यह भी पता चला है कि टीएनबीसी का एक विशिष्ट प्रतिरक्षा सूक्ष्म वातावरण होता है जिसमें संवहनी एंडोथेलियल वृद्धि कारक, ट्यूमर-संबंधित मैक्रोफेज (टीएएम), ट्यूमर-घुसपैठ करने वाले लिम्फोसाइट (टीआईएल) और ट्यूमर के विकास और प्रसार में शामिल अन्य अणुओं का उच्च स्तर होता है। इसलिए, टीएनबीसी के सूक्ष्म वातावरण को समझना इसके पूर्वानुमान और उपचार के लिए महत्वपूर्ण है (फैन और हे, 2022)।
टीएनबीसी के पूर्वानुमान का आकलन करने और प्रभावी उपचार सुनिश्चित करने के लिए, सटीक निदान महत्वपूर्ण है, जो मुख्य रूप से ईआर, पीआर और एचईआर2 का पता लगाने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) और स्तन नियोप्लाज्म का पता लगाने के लिए मैमोग्राफी पर आधारित है। हालांकि, मैमोग्राफी ट्यूमर के भीतर की विशेषताओं जैसे कि नेक्रोसिस और फाइब्रोसिस को पर्याप्त रूप से नहीं दर्शा सकती (दीपक सिंह एट अल., 2021)। चूंकि खराब पूर्वानुमान और निदान डॉक्टरों को सही दवाएं निर्धारित करने से रोकते हैं (चौधरी, 2020), टीएनबीसी के रोगियों की देखभाल में सुधार के लिए विभिन्न रणनीतियों का उपयोग किया जाता है। वर्तमान में, टीएनबीसी के रोगियों में डॉक्सोरूबिसिन और साइक्लोफॉस्फेमाइड नामक दो दवाओं का उपयोग किया जाता है और इनसे अच्छे परिणाम मिले हैं। इसके अलावा, कार्बोप्लैटिन और सिस्प्लैटिन जैसी अन्य प्लैटिनम दवाओं का भी उपयोग किया जाता है (सिकोव एट अल., 2015)। इसके अतिरिक्त, ओलापारिब, वेलापारिब और PF-01367338 जैसे PARP अवरोधकों का उपयोग TNBC के उपचार के लिए संभावित कीमोथेरेपी दवाओं के रूप में किया गया है (इशिनो एट अल., 2018)। चूंकि Wnt/b-कैटेनिन, NOTCH और हेजहोग सिग्नलिंग पाथवे TNBC की घटना और प्रगति में शामिल पाए गए हैं, इसलिए इन पाथवे को लक्षित करने वाली दवाओं का उपयोग एक महत्वपूर्ण रणनीति हो सकती है (आयसोला एट अल., 2013)। हालांकि आज भी TNBC के उपचार में सर्जरी, विकिरण चिकित्सा और कीमोथेरेपी मुख्य उपचार हैं, लेकिन लक्षित चिकित्सा, इम्यूनोथेरेपी, विभिन्न CRISPR-संबंधित जीन संपादन उपकरण जैसे Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, प्राइम एडिटिंग और CRISPR/Cas9-लक्षित जीन थेरेपी सहित नए उपचारों के विकास में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है। यहां हम TNBC के उपचार में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न CRISPR-संबंधित जीन संपादन उपकरणों पर ध्यान केंद्रित करेंगे। इनमें से, CRISPR/Cas9 को व्यापक रूप से ध्यान मिला है।
Cas9n, जिसे Cas9 निकेज़ के नाम से भी जाना जाता है, CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन प्रणाली से प्राप्त Cas9 प्रोटीन का एक आनुवंशिक रूप से संशोधित संस्करण है (गुप्ता एट अल., 2019)। अपने मूल रूप में, Cas9 प्रोटीन में दो न्यूक्लिएज़ डोमेन होते हैं: RuvC और HNH, जिनका मुख्य कार्य DNA के दोनों स्ट्रैंड्स को विखंडित करना है। हालांकि, Cas9n में, न्यूक्लिएज़ डोमेन में से एक, HNH, आनुवंशिक रूप से उत्परिवर्तित होकर निष्क्रिय हो जाता है। इसलिए, Cas9n का HNH डोमेन निष्क्रिय रहता है। केवल RuvC डोमेन ही सक्रिय रहता है, जिससे Cas9n एकल DNA स्ट्रैंड्स को काट या उनमें विखंडन कर सकता है (ट्रेविनो और झांग, 2014)। Cas9 की तुलना में, Cas9n लक्ष्य-विरोधी प्रभावों को प्रभावी ढंग से कम कर सकता है और कोशिका मरम्मत तंत्र को सटीक रूप से बेहतर बना सकता है। Cas9n का उपयोग विभिन्न समस्याओं को हल करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि दोहरे स्ट्रैंड वाले DNA में विशिष्ट स्थानों पर विखंडन करना। इस उद्देश्य के लिए, दो Cas9n अणुओं को संयोजित किया गया और एक साथ उपयोग किया गया (यी, 2016)। मिक्स्ड लीनिएज किनेज 3 (MLK3) एक माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेज है जो TNBC मेटास्टेसिस के दौरान एक प्रमुख नियामक के रूप में कार्य करता है (क्रोनन एट अल., 2012)।
MLK3 कई सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय कर सकता है जो TNBC मेटास्टेसिस की ओर ले जाते हैं। उदाहरण के लिए, c-Jun N-टर्मिनल काइनेज (JNK) मार्ग कोशिका गतिशीलता और बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स क्षरण को नियंत्रित करता है, और MLK3 JNK मार्ग को सक्रिय करता है, जिससे कोशिका गतिशीलता बढ़ती है और आक्रामक गुण प्रदान होते हैं (रत्तनासिंचाई और गैलो, 2016)। MLK3 ईएमटी को भी नियंत्रित करता है। ऐसा करने के लिए, यह स्नेल, स्लग और ट्विस्ट जैसे डाउनस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्शन कारकों को सक्रिय करता है। ये कारक उपकला मार्करों की अभिव्यक्ति को बाधित करते हैं और मेसेनकाइमल मार्करों की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देते हैं, जिससे मेटास्टेटिक फेनोटाइप प्राप्त होता है (कैसालिनो एट अल., 2023)। MLK3 को ईसीएम रीमॉडलिंग और मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज (MMPs) जैसे प्रोटीएज को सक्रिय करने में भूमिका निभाते हुए देखा गया है जो ईसीएम को नष्ट करते हैं। इससे ट्यूमर कोशिकाओं का आक्रमण और दूरस्थ स्थानों तक फैलना आसान हो जाता है (कटारी एट अल., 2019)। इस प्रकार, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एमएलके3 टीएनबीसी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। रत्तनासिंचाई और गैलो ने एमएलके3 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए टीएनबीसी मॉडल का उपयोग किया और पाया कि यह विशिष्ट सिग्नलिंग मार्गों के माध्यम से कैंसर के विकास को बढ़ावा देता है। उन्होंने एमएलके3 को संपादित करने के लिए CRISPR/Cas9n का उपयोग किया और टीएनबीसी मेटास्टेसिस में उल्लेखनीय कमी देखी (रत्तनासिंचाई और गैलो, 2016)।
dCas9, जिसे अक्सर निष्क्रिय Cas9 कहा जाता है, Cas9 प्रोटीन का एक संशोधित व्युत्पन्न रूप है। सक्रिय Cas9 के विपरीत, dCas9 में एंडोन्यूक्लिएज़ गतिविधि नहीं होती है, जिससे यह DNA के दोहरे स्ट्रैंड को तोड़ने में असमर्थ होता है। इसलिए, dCas9 का उपयोग DNA अनुक्रम में बिना किसी परिवर्तन या संशोधन के जीनोम के विशिष्ट क्षेत्रों को सटीक रूप से लक्षित करने के लिए किया जा सकता है (वांग एट अल., 2016)। dCas9 में, दो एंडोन्यूक्लिएज़ प्रोटीन, RuvC और HNH, महत्वपूर्ण अमीनो एसिड अवशेषों को दबाकर निष्क्रिय कर दिए जाते हैं (रिचटर एट अल., 2016)। DNA विखंडन गतिविधि की कमी के बावजूद, dCas9 आनुवंशिक अनुसंधान और जैव प्रौद्योगिकी में कई महत्वपूर्ण भूमिकाएँ निभाता है। उदाहरण के लिए, यह जीनोम के विशिष्ट क्षेत्रों के दृश्यीकरण की अनुमति देता है, प्रतिलेखन विनियमन को सुगम बनाता है, और एपिजेनेटिक संशोधनों को बढ़ावा देता है (ब्रोकेन एट अल., 2018)।
ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर ZEB1 (जिंक फिंगर ई-बॉक्स बाइंडिंग होमियोबॉक्स 1) एपिथेलियल-मेसेनकाइमल ट्रांजिशन (EMT) में एक विशिष्ट और महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो भ्रूण विकास, ऊतक मरम्मत और कैंसर की प्रगति के दौरान होने वाली एक कोशिकीय प्रक्रिया है। इसमें एपिथेलियल कोशिकाओं का मेसेनकाइमल कोशिकाओं में परिवर्तन शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिका आकृति विज्ञान, गतिशीलता, आक्रमणशीलता आदि में परिवर्तन होते हैं (वू एट अल., 2020)। ZEB1 कई एपिथेलियल मार्करों, जैसे कि ई-कैडेरिन और ऑक्लूडिन को रोकता है, जो टीएनबीसी में एपिथेलियल कोशिकाओं के कोशिका-कोशिका आसंजन और ध्रुवीयता को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार हैं (मोरेनो-ब्यूनो एट अल., 2008)। इसके अतिरिक्त, ZEB1 कुछ मार्करों जैसे N-कैडेरिन, विमेंटिन और फाइब्रोनेक्टिन (कोनराडी एट अल., 2014) को सक्रिय करता है और साथ ही साइटोस्केलेटल रीमॉडलिंग में शामिल जीन जैसे Rho GTPases और मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज़ (MMPs) (हुआंग एट अल., 2014) को भी नियंत्रित करता है। इसके अतिरिक्त, यह ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर-β (TGF-β), Wnt सिग्नलिंग आदि जैसे विभिन्न सिग्नलिंग मार्गों को भी प्रभावित करता है, जिससे TNBC में ट्यूमर के आक्रमण और मेटास्टेसिस को बढ़ावा मिलता है (चेन एट अल., 2016)। कई अध्ययनों और वैज्ञानिक प्रमाणों से संकेत मिलता है कि ZEB1 में TNBC के पता लगाने और चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए एक मूल्यवान एजेंट के रूप में अपार क्षमता है। एक हालिया अध्ययन में, वार्याह एट अल. ने TNBC मॉडल का उपयोग किया और dCas9 द्वारा ZEB1 का पूर्ण दमन प्राप्त किया। इस प्रकार, उन्होंने इन विवो स्थितियों में ZEB1 की बहुत उच्च विशिष्टता और लगभग पूर्ण अवरोध देखा (वार्याह एट अल., 2023)।
CRISPR/Cas12 एक जीन संपादन उपकरण है जिसे CRISPR/Cpf1 कहा जाता है। यह CRISPR/Cas प्रणाली से विकसित हुआ है, जहाँ Cas12 शब्द CRISPR-एसोसिएटेड प्रोटीन 12 (भरतकुमार एट अल., 2022) को संदर्भित करता है, जो Cas9 के बिल्कुल समान है। एकमात्र अंतर यह है कि इसमें Cas12 प्रोटीन होता है। Cas9 की तुलना में, Cas12 में कुछ विशिष्ट कार्य होते हैं जैसे जीन संपादन प्रक्रिया के दौरान चिपचिपे सिरे उत्पन्न करना, जबकि Cas9 कुंद सिरे उत्पन्न करता है (वांग एट अल., 2021)। Cas12 का यह गुण इसकी विशिष्ट डीएनए हेरफेर तकनीक में योगदान देता है। लक्ष्य डीएनए को सटीक रूप से पहचानने और काटने में सक्षम प्रोटीन होने के कारण, इसमें असाधारण बहुमुखी प्रतिभा है, जो इसे जीन संपादन सहित विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए एक प्रभावी उपकरण बनाती है (पिकर-ओलिवर और गेर्सबैक, 2019)।
अन्य CRISPR वेरिएंट की तरह, CRISPR/Cas12 भी TNBC में जीन को निष्क्रिय या सक्रिय करने में सक्षम है, उन जीनों को लक्षित करता है जो इसके रोगजनन या उपचार के प्रति प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं (यांग और झांग, 2023)। इस प्रक्रिया को पूरा करने के लिए, एक गाइड RNA (gRNA) विकसित किया गया था जो Cas12 को लक्षित जीन तक निर्देशित करता है। Cas12 के अपने लक्ष्य से जुड़ने के बाद, यह DNA में दोहरे-स्ट्रैंड ब्रेक उत्पन्न करता है और DNA मरम्मत तंत्र को सक्रिय करता है। मरम्मत प्रक्रिया के दौरान, गलत न्यूक्लियोटाइड शामिल हो सकते हैं, जिससे जीन उत्परिवर्तन और कार्यक्षमता में कमी आ सकती है (झांग एट अल., 2021a)। इसके अलावा, जीनों को सक्रिय करने के लिए Cas12 एंजाइम के एक उन्नत संस्करण (जिसे dCas12 कहा जाता है) का भी उपयोग किया गया था। इसे एक ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर के साथ मिलाकर, कुछ जीनों को प्रेरित करना और उन्हें सक्रिय करना संभव है। इस तकनीक में ट्यूमर सप्रेसर जीनों की सक्रियता को बढ़ावा देने की अपार क्षमता है (सुल्तान एट अल., 2022)।
प्राइम एडिटिंग एक नई विकसित और अत्यंत उन्नत जीनोम एडिटिंग तकनीक है। यह किसी जीव के डीएनए को बहुत सटीक रूप से संशोधित करने में सक्षम है (चेन और लियू, 2023)। प्राइम एडिटिंग दो मुख्य घटकों के एकीकरण के माध्यम से प्राप्त की जाती है: एक संशोधित CRISPR/Cas9 एंजाइम और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस। CRISPR/Cas9 एंजाइम की भूमिका जीनोम में सटीक स्थलों को चुनिंदा रूप से लक्षित करना है, जबकि रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस लक्षित स्थान पर डीएनए को पूरी तरह से संशोधित करने में मदद करता है (हसन एट अल., 2021)। प्राइम एडिटिंग तंत्र में, पहला चरण प्राइम एडिटिंग गाइड आरएनए (pegRNA) का निर्माण करना है (स्टैंडेज-बेयर एट अल., 2021)। इसमें लक्षित डीएनए में वांछित संपादन स्थल के अनुरूप लक्षित अनुक्रम और आरएनए टेम्पलेट होता है। इसके बाद pegRNA को प्राइम एडिटिंग न्यूक्लिएज (PE2) के साथ लक्षित कोशिकाओं में डाला जाता है। PE2 एक संलयन प्रोटीन है जिसमें Cas9 एंजाइम, एक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ और एक प्राइमर एडिटिंग एडेप्टर शामिल होते हैं (मार्टिन-अलोंसो एट अल., 2021)। कोशिका के अंदर, pegRNA और PE2 कॉम्प्लेक्स उस विशिष्ट DNA की खोज करते हैं जिसे वे संशोधित करना चाहते हैं। Cas9 एंजाइम DNA को काटता है और एकल स्ट्रैंड से बना एक टेम्पलेट बनाता है (चोई एट अल., 2022)। रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ इस टेम्पलेट का उपयोग DNA को संपादन के लिए तैयार करने के लिए करता है। DNA की प्रतिलिपि बनाने के साथ-साथ, RNA टेम्पलेट को संपादित करने के निर्देश भी शामिल होते हैं। अंत में, नव निर्मित DNA स्ट्रैंड का उपयोग DNA में टूटन की मरम्मत के लिए टेम्पलेट के रूप में किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप वांछित संशोधन युक्त एक परिवर्तित DNA अनुक्रम प्राप्त होता है (ओचोआ-सांचेज़ एट अल., 2021)। प्राइमर एडिटिंग तंत्र जीन में व्यापक उत्परिवर्तन का कारण बन सकते हैं। यह बिंदु उत्परिवर्तन, सम्मिलन, विलोपन और यहां तक ​​कि जीन प्रतिस्थापन को भी लक्षित कर सकता है (एंज़ालोन एट अल., 2019; चेन और लियू, 2023)। प्राइम एडिटिंग पिछली जीनोम एडिटिंग तकनीकों की तुलना में कई फायदे प्रदान करती है। इनमें बढ़ी हुई सटीकता, ऑफ-टारगेट प्रभावों में कमी और डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक पर निर्भर किए बिना डीएनए को एडिट करने की क्षमता शामिल है (एंज़ालोन एट अल., 2020)।
CRISPR/Cas9 तकनीक को मूल रूप से बैक्टीरिया को प्लास्मिड स्थानांतरण और फ़ेज संक्रमण से बचाने के लिए विकसित किया गया था और बाद में इसे जीनोम संपादन के लिए एक प्रभावी RNA-आधारित DNA लक्ष्यीकरण उपकरण के रूप में पुनः उपयोग में लाया गया (जियांग और डौडना, 2017)। इसके अतिरिक्त, CRISPR/Cas9 प्रणाली को क्रमशः 50% और 87% जीवाणु और आर्कियल जीनोम में मौजूद होने की सूचना दी गई है (इशिनो एट अल., 2018)। CRISPR/Cas9 इन विवो और इन विट्रो विधियों का उपयोग करके किसी भी असामान्य आनुवंशिक अनुक्रम के विलोपन, सम्मिलन और सुधार के लिए एक संभावित उपकरण है (साबित एट अल., 2021)। इसके अलावा, CRISPR/Cas9 को रुचि के लक्षित जीनों के लिए इसकी विशिष्टता के कारण अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली का हिस्सा दिखाया गया है (चेन और झांग, 2018)।
CRISPR/Cas9 में Cas9 और एक गाइड RNA (sgRNA) शामिल होते हैं। Cas9 एक एंडोन्यूक्लिएज़ है जो कई प्रोटीन घटकों से मिलकर बना होता है। इसके अतिरिक्त, Cas9 में अद्वितीय संरचनात्मक और संरूपणीय गुण होते हैं (पेसेसा एट अल., 2022) क्योंकि इसमें दो लोब होते हैं: पहचान (REC) और न्यूक्लिएज़ (NUC)। REC लोब को आगे तीन क्षेत्रों में विभाजित किया गया है: REC1, REC2 और ब्रिज हेलिक्स (क्रोमवेल एट अल., 2018)। NUC में तीन लोब होते हैं, अर्थात् RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH और प्रोटोस्पेस एडजेसेंट मोटिफ (PAM) इंटरैक्शन डोमेन (चित्र 1) (सॉन्ग एट अल., 2016)। sgRNA में दो घटक होते हैं, जिनमें CRISPR RNA (crRNA) और ट्रांसकोडिंग स्मॉल RNA (ट्रेसर RNA) शामिल हैं (चित्र 1)। sgRNA, Cas9 प्रोटीन को connexins से जोड़कर एक सक्रिय कॉम्प्लेक्स बनाता है, जिसे इफेक्टर कॉम्प्लेक्स भी कहा जाता है (रिचटर एट अल., 2012)। crRNA 18-20 न्यूक्लियोटाइड का एक युग्म होता है जो लक्ष्य DNA अनुक्रमों को पहचानने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसके अतिरिक्त, crRNA लक्ष्य DNA के साथ युग्मित होता है, और tracrRNA, Cas9 न्यूक्लिएज को लक्ष्य DNA से जुड़ने के लिए एक आधार प्रदान करता है (मंगवार एट अल., 2019)। दूसरी ओर, PAM अनुक्रम में 3 न्यूक्लियोटाइड होते हैं, जो इफेक्टर कॉम्प्लेक्स के DNA से जुड़ने की पुष्टि, विशिष्टता और मध्यस्थता करते हैं। Cas9 प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की उप-इकाइयाँ RuvC और HNH उत्प्रेरक सक्रियता प्रदर्शित करती हैं (रिचटर एट अल., 2012; अस्मामाव और ज़ावडी, 2021)। Cas9 उप-इकाई का HNH न्यूक्लिएज डोमेन crRNA से जुड़े DNA स्ट्रैंड को विखंडित करता है। रुवसी न्यूक्लिएज़ डोमेन अन्य डीएनए स्ट्रैंड्स को काटता है और डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) उत्पन्न करता है, जिसके बाद दो अलग-अलग डीएनए ब्रेक मरम्मत तंत्र सक्रिय हो जाते हैं (जियांग और डौडना, 2017) (चित्र 1)।
चित्र 1. CRISPR/Cas9 का अवलोकन (A)। CRISPR/Cas9 प्रणाली के घटक: (i) Cas9 एंडोन्यूक्लिएज़ लक्षित DNA अनुक्रम को काटने के लिए जिम्मेदार है, (ii) crRNA और tra-crRNA काइमेरा के संलयन से उत्पन्न एकल गाइड (sg) RNA। (2) Cas9 में Rec I, Rec II, NUC लोब (HNH और Ruv C उपघटक हैं) और PAM अंतःक्रिया डोमेन जैसे कई घटक शामिल हैं, जिनके अपने-अपने कार्य हैं। (C) CRISPR/Cas9 प्रोटीन कॉम्प्लेक्स DNA अनुक्रमों को गैर-पूरक और पूरक रूपों में विभाजित करता है। (D) CRISPR/Cas9 जीनोम को तीन चरणों में संपादित करता है: पहचान, काटना और मरम्मत। डिज़ाइन किया गया sg-RNA Cas9 का मार्गदर्शन करता है और पूरक घटक crRNA के माध्यम से वांछित अनुक्रम को पहचानता है। Cas9 5′-NGG-3′ पर PAM अनुक्रम को पहचानता है और DNA को पिघलाकर DNA-RNA संकर बनाता है और विखंडन को सक्रिय करता है। Cas9 का HNH डोमेन पूरक स्ट्रैंड को काटता है, और RuvC डोमेन गैर-पूरक स्ट्रैंड को काटता है। CRISPR/Cas9 दो तरीकों से dsDNA की मरम्मत करता है: गैर-समरूप छोर संयोजन (NHEJ) और समरूपता-निर्देशित मरम्मत (HDR)। NHEJ एंजाइमेटिक प्रक्रिया के माध्यम से विदेशी समरूप DNA की अनुपस्थिति में दोहरे स्ट्रैंड वाले DNA की मरम्मत करता है, जो एक त्रुटि-प्रवण तंत्र है और यादृच्छिक DNA अनुक्रमों को सम्मिलित या हटा सकता है। HDR बहुत विशिष्ट होता है और इसके लिए समरूप DNA टेम्पलेट की आवश्यकता होती है।
CRISPR/Cas9-मध्यस्थता वाले मरम्मत मार्गों में गैर-समरूप अंत संयोजन (NHEJ) और समरूपता-निर्देशित मरम्मत (HDR) तंत्र शामिल हैं। NHEJ एक त्रुटि-प्रवण मार्ग है क्योंकि इसमें सम्मिलन या विलोपन शामिल होता है और मरम्मत तंत्र के दौरान किसी भी पैटर्न की आवश्यकता नहीं होती है। यह मानक प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए यादृच्छिक न्यूक्लियोटाइड का उपयोग करता है (अब्बासी एट अल., 2021)। इस मरम्मत प्रणाली में चार कॉम्प्लेक्स होते हैं जैसे कि KU कॉम्प्लेक्स, क्रॉस-कॉम्प्लीमेंटिंग प्रोटीन कॉम्प्लेक्स टाइप 4 (XRCC-4), DNA अंत प्रसंस्करण एंजाइम और प्रोटीन काइनेज DNA-PKcs (अब्बासी एट अल., 2021)। KU कॉम्प्लेक्स प्रोटीन में दो सबयूनिट, Ku 70 और Ku 80 होते हैं, और यह NHEJ तंत्र में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, क्योंकि मरम्मत तंत्र की शुरुआत दो सबयूनिट (Ku 70 और Ku 80) के लक्ष्य DNA के कुंद या लगभग कुंद सिरों से जुड़ने से होती है (अब्बासी एट अल., 2021), जो चोट के स्थान पर अन्य NHEJ-संबंधित कारकों को लाने के लिए एक ढाँचे के रूप में कार्य करता है (यांग एट अल., 2020)। XRCC-4 और DNA लाइगेज क्रमशः 334 और 911 अमीनो एसिड से बने होते हैं, और XRCC4-DNA लाइगेज IV कॉम्प्लेक्स DNA सिरों के लिगेशन को उत्तेजित करता है (चटर्जी एट अल., 2015)। DNA एंड प्रोसेसिंग एंजाइम, जिसे पॉली न्यूक्लियोटाइड काइनेज 3'-फॉस्फेट के रूप में भी जाना जाता है, एक DNA एंड प्रोसेसिंग एंजाइम है। यह डीएनए में 3′P समूह को हटा सकता है और डीएसबी मरम्मत के दौरान 5′OH समूह को फॉस्फोराइलेट कर सकता है। इसमें एसएसबी मरम्मत मार्ग का उपयोग करके एकल-स्ट्रैंड ब्रेक (एसएसबी) की मरम्मत भी शामिल है (चटर्जी एट अल., 2015)। प्रोटीन काइनेज डीएनए-पीकेसीएस एक डीएनए-निर्भर प्रोटीन काइनेज है जिसमें पीआईकेकेएस (फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल 3-काइनेज-संबंधित काइनेज) और एटैक्सिया टेलेंजियाक्टेसिया म्यूटेटेड (एटीएम) परिवार की एक उत्प्रेरक उप-इकाई, साथ ही एटीएम और रेड3-संबंधित एटीआर शामिल हैं। (यू एट अल., 2020; पेंग एट अल., 2016)।
एचडीआर एक अधिक सटीक और उपयुक्त मरम्मत तंत्र है क्योंकि इसमें समरूप डीएनए डुप्लेक्स के अक्षुण्ण रूप का उपयोग करके जानकारी की प्रतिलिपि बनाई जाती है, हालांकि इसके लिए सिस्टर क्रोमेटिड्स की उपस्थिति आवश्यक है। यह स्तनधारी कोशिका चक्र के एस/जी2 चरण के दौरान होता है। एचडीआर मुख्य रूप से यीस्ट प्रजातियों में होता है, लेकिन स्तनधारियों में एनएचईजे (NHEJ) महत्वपूर्ण है (बर्मा एट अल., 2006; अब्बासी एट अल., 2021)। संपूर्ण मरम्मत तंत्र चित्र 1 में दर्शाया गया है।
चूंकि टीएनबीसी आनुवंशिक और एपिजेनेटिक असामान्यताओं के कारण होता है, इसलिए CRISPR/Cas9 का उपयोग करके घातक जीनोमिक/एपिजेनोमिक असामान्यताओं का सुधार एक उपयुक्त चिकित्सीय दृष्टिकोण हो सकता है (चेन एट अल., 2019)। इसके अतिरिक्त, कोशिका-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन में शामिल कुछ ट्रांसक्रिप्शन कारक कैंसर कोशिकाओं की अनूठी विशेषताओं को प्रदर्शित कर सकते हैं, जिससे पता चलता है कि ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन कैंसर उपचार के लिए एक उत्कृष्ट दृष्टिकोण हो सकता है (ड्रोस्ट एट अल., 2017)। ट्यूमर की इन आणविक विशेषताओं, जैसे कि आनुवंशिक, एपिजेनेटिक और ट्रांसक्रिप्शनल दोषों का उपयोग दवा विकास के लिए करने से नैदानिक ​​परिणामों में सुधार हो सकता है और स्क्रीनिंग लागत कम हो सकती है। CRISPR एक संभावित जीन संपादन उपकरण है जो न केवल कैंसर पैदा करने वाले जीनोमिक लक्ष्यों का पता लगा सकता है और उनकी पहचान कर सकता है, बल्कि इसका उपयोग मानव कोशिकाओं में ऑन्कोजीन को संपादित करने, दबाने और एपिजेनेटिक रूप से संशोधित करने के लिए भी किया जा सकता है (तालिका 1) (अहमद एट अल., 2021)। ट्यूमर सप्रेसर, ऑन्कोजीन और दवा प्रतिरोध से जुड़े जीनों की खोज के लिए कई CRISPR स्क्रीनिंग की गई हैं। चित्र 2 में विभिन्न टीएनबीसी ऑन्कोजीन को संपादित करने के लिए CRISPR/Cas9 के उपयोग को दर्शाया गया है।
चित्र 2. CRISPR/Cas9 का उपयोग करके विभिन्न TNBC ऑन्कोजीन का जीन संपादन, जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर की वृद्धि और मेटास्टेसिस में कमी आई है। इन ऑन्कोजीन में CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 और CXCR7, Crypto1, ROR1 और ST8SIA शामिल हैं, जो TNBC की घटना और मेटास्टेसिस में भूमिका निभाते हैं।
कैंसर कोशिकाओं का प्रवासन, आक्रमण और उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) आईटीजीए9 से संबंधित हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि आईटीजीए9 नॉच पाथवे में एक प्रमुख भूमिका निभाता है और रैबडोमायोसारकोमा मेटास्टेसिस में एक रोचक भूमिका निभाता है (मोलिस्ट एट अल., 2020)। इसके अतिरिक्त, आईटीजीए9 कई प्रकार के ट्यूमर में रोगी के पूर्वानुमान से निकटता से जुड़ा हुआ पाया गया है, जिसमें स्तन कैंसर भी शामिल है (वांग जेड एट अल., 2019)। साथ ही, आईटीजीए9 के बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण से पता चला है कि टीएनबीसी में इसकी अभिव्यक्ति अन्य स्तन कैंसर उपप्रकारों की तुलना में काफी अधिक है। आईटीजीए9 के उच्च स्तर टीएनबीसी रोगियों में ट्यूमर मेटास्टेसिस और पुनरावृत्ति से जुड़े हैं। सीआरआईएसपीआर/कैस9 द्वारा आईटीजीए9 के नॉकआउट के परिणामस्वरूप टीएनबीसी में β-कैटेनिन क्षरण को बढ़ावा देकर कैंसर स्टेम सेल (सीएससी)-जैसे गुण, ट्यूमर एंजियोजेनेसिस, ट्यूमर वृद्धि और मेटास्टेसिस में कमी आई (वांग जेड एट अल., 2019)।
क्रिप्टो-1, TGF-β परिवार का एक सदस्य है और प्रारंभिक भ्रूणजनन, स्टेम सेल के रखरखाव और कैंसर मेटास्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण है (इशी एट अल., 2021)। इसे Tdgf-1 के नाम से भी जाना जाता है, यह एक ऑन्कोजेनिक GPI-एंकर वाला सिग्नलिंग प्रोटीन है जो प्रिमिटिव स्ट्रीक, मेसोडर्म और एंडोडर्म के निर्माण के नियमन के साथ-साथ भ्रूणजनन के दौरान शरीर के अंगों के विकास में बाएं/दाएं विषमता की स्थापना में शामिल होता है (झांग एट अल., 2021b)। इसके अतिरिक्त, क्रिप्टो-1 को स्टेम सेल मार्कर के रूप में एपिथेलियल-मेसेनकाइमल ट्रांजिशन (EMT) में शामिल दिखाया गया है (झांग एट अल., 2021b)। EMT न केवल भ्रूण विकास, फाइब्रोसिस और घाव भरने जैसी विभिन्न प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है, बल्कि कैंसर के आक्रमण और मेटास्टेसिस के लिए भी महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, क्रिप्टो-1 को चार नॉच रिसेप्टर्स के साथ परस्पर क्रिया करते हुए और उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल परिपक्वता को बढ़ाते हुए दिखाया गया है (ब्रांडस्टैडटर और मैलार्ड, 2019)। नॉच सिग्नलिंग पाथवे मानव स्तन कैंसर कोशिकाओं के रखरखाव में शामिल माना जाता है। अध्ययनों से पता चला है कि CRISPR/Cas9 द्वारा क्रिप्टो-1 के नॉकआउट से कैंसर की वृद्धि और मेटास्टेसिस दब जाती है। इसलिए, क्रिप्टो-1 टीएनबीसी के लिए एक महत्वपूर्ण चिकित्सीय लक्ष्य बन सकता है (कास्त्रो एट अल., 2015)।
XCL12 प्रोटीन और इसके कीमोकाइन रिसेप्टर CXC (CXCR4 और CXCR7) कैंसर कोशिकाओं के प्रसार, वृद्धि, प्रवासन और आक्रमण में विभिन्न भूमिकाएँ निभाते हैं (वू एट अल., 2015)। इन कीमोरिसेप्टर्स को इन विवो और इन विट्रो दोनों मॉडलों में कई सिग्नलिंग मार्गों के माध्यम से TNBC के विकास से जोड़ा गया है (वू एट अल., 2015)। इसके अलावा, CXCR4 और CXCR7 की सक्रियता TNBC में मेटास्टेसिस के प्रति अधिक संवेदनशीलता और खराब पूर्वानुमान से जुड़ी है (कर्ण एट अल., 2022)। इसलिए, CXCR4 और CXCR7 का नॉकआउट TNBC सहित स्तन कैंसर के उपचार के लिए प्रभावी दवा लक्ष्य जीन बन सकता है। यांग एट अल. द्वारा किया गया अध्ययन। यांग एट अल (2019) ने CXCR4 और CXCR7 जीन को सह-नॉकआउट करने के लिए CRISPR/Cas9 का उपयोग किया और पाया कि TNBC प्रसार, वृद्धि, प्रवासन और आक्रमण काफी हद तक बाधित थे (यांग एट अल, 2019)।
स्तन कैंसर के ऊतकों में टीएनबीसी ऑन्कोजीन miR-3662 का स्तर बढ़ा हुआ पाया गया (यी एट अल., 2022)। miR-3662 के नॉकडाउन से स्तन कैंसर ट्यूमर की वृद्धि और मेटास्टेसिस को इन विवो और इन विट्रो दोनों में बाधित करने की क्षमता प्रदर्शित की गई है (अग्रवाल और गुप्ता, 2021)। HBP-1, Wnt/-कैटेनिन सिग्नलिंग का एक शक्तिशाली अवरोधक है और संभवतः miR-3662-मध्यस्थता से होने वाली टीएनबीसी कोशिकाओं की वृद्धि के लिए जिम्मेदार है। हाल ही में, यी एट अल. ने पाया कि miR-3662-HBP1 अक्ष टीएनबीसी कोशिकाओं में Wnt/-कैटेनिन सिग्नलिंग मार्ग को नियंत्रित करता है (यी एट अल., 2022)। ट्यूमर-विशिष्ट अभिव्यक्ति के कारण, miR-3662 टीएनबीसी के लिए एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य हो सकता है। इस प्रकार, CRISPR/Cas9 द्वारा miR-3662 का नॉकडाउन, TNBC के उपचार के लिए नई दवाएं विकसित करने का एक उत्कृष्ट तरीका हो सकता है।
UBR5 एक 300 kDa न्यूक्लियोफॉस्फोप्रोटीन है जिसे विभिन्न कैंसरों में ट्यूमरजनन, मेटास्टेसिस और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रमुख नियामक के रूप में पहचाना गया है (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023)। TNBC नमूनों में UBR5 की उच्च स्तरता पाई गई है और यह अपनी यूबिक्विटिन लाइगेज गतिविधि के माध्यम से प्रसार को प्रेरित करके ERα कार्य को उत्तेजित करता है (Bolt et al., 2015)। प्राथमिक TNBC नमूनों के संपूर्ण एक्सोम अनुक्रमण अध्ययनों में भी UBR5 की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति देखी गई, जो TNBC के विकास में इसकी भूमिका का संकेत देती है। इसके अतिरिक्त, प्रायोगिक माउस मॉडल में CRISPR/Cas9 द्वारा संचालित UBR5 के विलोपन से TNBC मेटास्टेसिस और वृद्धि में महत्वपूर्ण अवरोध देखा गया। इसके अलावा, एक वाइल्ड-टाइप माउस मॉडल में UBR5 को शामिल करने से इसकी पूर्ण कार्यक्षमता बहाल हो गई, जबकि निष्क्रिय उत्परिवर्ती उपभेदों में यह प्रभाव नहीं देखा गया (लियाओ एट अल., 2017)। UBR5 की कमी TNBC में अपोप्टोसिस, नेक्रोसिस और ट्यूमर वृद्धि के अवरोध से जुड़ी है, जिसका कारण खराब एंजियोजेनेसिस है। UBR5 की कमी के कारण, दूर के अंगों में ट्यूमर का फैलाव कम हो जाता है, और UBR5 मुख्य रूप से E-कैडेरिन अभिव्यक्ति को कम करके असामान्य EMT को प्रेरित करता है (झांग और वेनबर्ग, 2018)। हाल ही में, UBR5 को TNBC में IFN-γ-प्रेरित PDL1 प्रतिलेखन में एक बहुत महत्वपूर्ण कारक दिखाया गया है, क्योंकि इसमें E3 यूबिक्विटिनेशन गतिविधि की कमी है। RNA ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण से पता चला है कि UBR5 का IFN-γ मार्ग से जुड़े जीनों पर प्रणालीगत प्रभाव हो सकता है और प्रोटीन काइनेज RNA (PKR) और इसके सिग्नल ट्रांसड्यूसर और एक्टिवेटर के सक्रियण स्तर को बढ़ाकर PDL1 ट्रांसएक्टिवेशन को बढ़ावा दे सकता है। ट्रांसक्रिप्शन 1 (STAT1) और इंटरफेरॉन रेगुलेटरी फैक्टर 1 (IRF1) को प्रभावित करते हैं। हालांकि, CRISPR/Cas9 द्वारा UBR5 और PD-L1 अभिव्यक्ति के संयुक्त उन्मूलन का चिकित्सीय प्रभाव अकेले किसी भी अवरोध की तुलना में कहीं अधिक सहक्रियात्मक होता है, और ट्यूमर के सूक्ष्म वातावरण पर इसका गहरा प्रभाव पड़ता है (वू एट अल., 2022)। इस प्रकार, CRISPR/Cas9 UBR5 के कार्य को बाधित करने का एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है, जिससे TNBC मेटास्टेसिस और ट्यूमर के विकास को दबाया जा सकता है।
ROR1 एक टाइप I ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन है जो कैंसर और भ्रूण विकास के दौरान व्यक्त होता है और इसे ऑन्कोफेटल प्रोटीन के रूप में पहचाना गया है (निकोलस बोरचेर्डिंग, 2014)। विभिन्न मानव कैंसरों का आक्रामक व्यवहार ROR1 के अपरेगुलेशन से जुड़ा है। ROR1 को लक्षित करने वाले चिकित्सीय यौगिकों से संबंधित इन विवो और इन विट्रो अध्ययनों से आशाजनक परिणाम प्राप्त हुए हैं (चिएन एट अल., 2016)। स्तन ऊतक बायोप्सी में ROR1 mRNA के उच्च स्तर को आक्रामक बेसल-लाइक ब्रेस्ट (BL) ट्यूमर और शरीर के अन्य भागों में उनके माइग्रेशन से भी जोड़ा गया है। इसके अलावा, ROR1 के ओवरएक्सप्रेशन को TNBC के विकास के लिए एक पूर्वानुमानित मार्कर के रूप में पहचाना गया है (चिएन एट अल., 2016)। हालांकि, TNBC की वृद्धि और मेटास्टेसिस को दबाने के लिए CRISPR/Cas9 का उपयोग करके ROR1 को साइलेंस करना एक प्रभावी रणनीति होगी।
सियाइलेशन प्रक्रिया में ग्लाइकोकॉन्जुगेट्स में सियालिक एसिड का जुड़ना शामिल है, जो सियाइलट्रांसफरेज़ (एसटी) द्वारा उत्प्रेरित होता है। ST8SIA1 एसटी परिवार से संबंधित है और लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया और कोलोरेक्टल कैंसर जैसी विभिन्न बीमारियों के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है (चांग एट अल., 2018)। आरएनए अनुक्रम विश्लेषण से पता चलता है कि ST8SIA1 टीएनबीसी रोगियों के स्तन ऊतक में उच्च स्तर पर व्यक्त होता है और ट्यूमर सप्रेसर जीन p53 में उत्परिवर्तन के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबंधित है, जो टीएनबीसी के रोगजनन में योगदान दे सकता है (बट्टुला एट अल., 2017)। इसके अतिरिक्त, ST8SIA1 टीएनबीसी के मेटास्टेसिस और पुनरावृत्ति में शामिल है, जो दर्शाता है कि यह टीएनबीसी की घटना और विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। टीएनबीसी के इन विट्रो मॉडल में, CRIPSR/Cas9 द्वारा ST8SIA1 के नॉकडाउन से वृद्धि और मेटास्टेसिस को अवरुद्ध करने में सफलता मिली (बट्टुला एट अल., 2017)। इससे पता चलता है कि टीएनबीसी के उपचार में ST8SIA1 ऑन्कोजीन के कार्य को बाधित करने के लिए CRISPR/Cas9 एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है।
NAT1 एक चयापचय एंजाइम है जो चरण II ज़ेनोबायोटिक यौगिकों के निर्माण को उत्प्रेरित करता है और लगभग सभी मानव ऊतकों में व्यक्त होता है। NAT1, एरोमैटिक एमीन सब्सट्रेट की अनुपस्थिति में भी एसिटाइल-CoA (एसिटाइल-CoA) को लक्षित करने के लिए कोफ़ैक्टर फोलेट का उपयोग कर सकता है (स्टेप्प एट अल., 2015; लॉरिएरी एट अल., 2014)। अध्ययनों से पता चला है कि NAT1 स्तन कैंसर कोशिका मॉडलों में मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज़ 9 (MMP9) के कार्य को नियंत्रित करता है और ग्लूकोज की कमी के दौरान प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) से सुरक्षा प्रदान करता है (वांग एट अल., 2018)। NAT1 के विलोपन से पाइरुवेट डीहाइड्रोजनेज़ कॉम्प्लेक्स का अवरोध देखा गया है, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता उत्पन्न होती है (वांग एल. एट अल., 2019)। इसके अतिरिक्त, कई अन्य रिपोर्टों से पता चला है कि छोटे अणुओं और siRNA साइलेंसिंग का उपयोग करके NAT1 अवरोधन स्तन कैंसर कोशिकाओं की आक्रमणशीलता और प्रसार को कम कर सकता है (स्टेप्प एट अल., 2018)। हाल ही में, CRISPR/Cas9 का उपयोग स्तन कैंसर सेल लाइन MDA-MB-231 में NAT1 को दबाने के लिए किया गया था, जिससे इसके अभिव्यक्ति स्तर के आधार पर कोशिकीय चयापचय प्रभावित हुआ। इस अध्ययन से यह भी पता चला कि NAT-1 स्तन कैंसर (TNBC) की प्रगति और मेटास्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण है (कार्लिस्ले एट अल., 2020)।
ऑन्कोजीन के समन्वित प्रतिलेखन को सुपर एनहांसर, प्रतिलेखन कारक और सहकारक द्वारा विनियमित किया जाता है (ह्निज़ एट अल., 2015)। इसके अतिरिक्त, प्रतिलेखन विनियमन के लिए साइक्लिन-निर्भर किनेज (सीडीके) के एक समूह, जैसे कि सीडीके7, सीडीके8, सीडीके9, सीडीके12 और सीडीके13 की आवश्यकता होती है। इनमें से, सीडीके7 आरएनए पॉलीमरेज़ II के फॉस्फोरिलेशन में शामिल होता है, जो टीएनबीसी के रोगजनन में ऑन्कोजीन प्रतिलेखन की शुरुआत और विस्तार के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। एक महत्वपूर्ण अध्ययन में, CRISPR/Cas9 द्वारा सीडीके7 के विलोपन ने टीएनबीसी को बाधित किया, यह दर्शाता है कि टीएनबीसी का रोगजनन सीडीके7 पर निर्भर है (वांग वाई. एट अल., 2015)।
अध्ययनों से पता चला है कि MYC और RBP (RNA बाइंडिंग प्रोटीन) में उत्परिवर्तन से एपोप्टोसिस हो सकता है, जबकि MYC या RBP में एकल जीन उत्परिवर्तन कैंसर कोशिकाओं की वृद्धि को प्रभावित नहीं करते हैं (आइंस्टीन एट अल., 2021)। CRISPR/Cas9-आधारित लाइब्रेरी का उपयोग करके मानव जीनोम में 1000 से अधिक RBP की स्क्रीनिंग की गई है। इनमें से, 57 RBP कैंसर कोशिकाओं की वृद्धि के लिए महत्वपूर्ण पाए गए जिनमें MYC का स्तर बहुत अधिक था (व्हीलर एट अल., 2020)। इसके अतिरिक्त, YTHDF2 TNBC कोशिका वृद्धि को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है और उच्च MYC अभिव्यक्ति वाली कैंसर कोशिकाओं में उच्च-स्तरीय प्रतिलेखन और अनुवाद के दौरान मिथाइलेटेड प्रतिलेखों की मात्रा को कम करता है। इसके अतिरिक्त, YTHDF2 कैंसर कोशिकाओं के लिए आवश्यक नहीं है, जो TNBC रोगियों के जीवित रहने की अवधि बढ़ाने के लिए उच्च MYC स्तरों पर कम निर्भर हैं (आइंस्टीन एट अल., 2021), यह सुझाव देता है कि यह उन दवाओं के लिए एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य हो सकता है जो TNBC पर काबू पा सकती हैं।
जिंक फिंगर प्रोटीन (ZNF) मानव जीनोम का लगभग 1% भाग बनाते हैं। अध्ययनों से पता चला है कि ZNF विभिन्न कैंसरों, जैसे कि लिवर कैंसर, स्तन कैंसर और कोलोरेक्टल कैंसर में कोशिका प्रसार को नियंत्रित कर सकते हैं (झांग डब्ल्यू एट अल., 2021; ली एट अल., 2017)। CRISPR नॉकआउट द्वारा उत्पन्न लाइब्रेरी का उपयोग स्तन कैंसर कोशिकाओं में विभिन्न ट्यूमर सप्रेसर जीन (TSG) की स्क्रीनिंग के लिए किया गया है (शालेम एट अल., 2014)। इसके बाद, CRISPR/Cas9 ZNF319-डिलीटेड स्तन कैंसर कोशिकाओं के एक ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययन से पता चला है कि ZNF319 एक ट्यूमर सप्रेसर जीन है जो स्तन कैंसर के प्रसार को कम करता है और इसलिए विभिन्न संभावित सिग्नलिंग तंत्रों और अन्य जैविक कार्यों में शामिल है (वांग एल एट अल., 2022)।
फेरोप्टोसिस एक प्रकार की प्रोग्राम्ड सेल डेथ है जो आयरन की उपस्थिति पर निर्भर करती है। यह ज्ञात है कि फेरोप्टोसिस का विकास लिपिड पेरोक्साइड की उपस्थिति से प्रभावित होता है। इसके अतिरिक्त, PKCβII में प्रारंभिक लिपिड पेरोक्सीडेशन की उपस्थिति देखी गई है, और बढ़ा हुआ लिपिड पेरोक्सीडेशन फेरोप्टोसिस से जुड़ा हुआ है। CRISPR/Cas9-मध्यस्थता वाले काइनेज अवरोधकों की एक लाइब्रेरी की स्क्रीनिंग से पता चला है कि PKCβII लिपिड पेरोक्सीडेशन की प्रक्रिया में शामिल है, जो MDA-MB-231 कोशिकाओं में फेरोप्टोसिस के लिए महत्वपूर्ण है (झांग एट अल., 2022)। इसलिए, यह सुझाव देता है कि CRISPR/Cas9 द्वारा PKCβII का नॉकआउट फेरोप्टोसिस से संबंधित रोगों के उपचार के लिए एक संभावित ट्यूमर सप्रेसर जीन लक्ष्य हो सकता है (झांग एट अल., 2022)।
कैंसर रोगियों में लगभग 90% मौतों के लिए दवा प्रतिरोध को जिम्मेदार माना जाता है और यह कैंसर उपचार में एक प्रमुख चुनौती है (बुकोव्स्की एट अल., 2020)। परिणाम बताते हैं कि दवा के बहिर्वाह, डीएनए मरम्मत, एपोप्टोसिस और विभिन्न सेल सिग्नलिंग मार्गों से संबंधित पर्याप्त संख्या में जीन दवा प्रतिरोध से जुड़े हैं (हैदर एट अल., 2020)। इनमें से, कई जीनों को CRISPR/Cas9 उपकरणों द्वारा लक्षित किया गया है और दवा प्रतिरोध को कम करने और कैंसर विरोधी उपचारों की प्रभावशीलता बढ़ाने में आशाजनक परिणाम दिखाए हैं (वाघारी-तबारी एट अल., 2022)। इसके अतिरिक्त, उच्च-थ्रूपुट CRISPR/Cas9 जीन नॉकआउट स्क्रीनिंग लाइब्रेरी को संभावित दवा प्रतिरोध जीन लक्ष्यों के कार्य को संशोधित करने में शामिल किया गया है (शालेम एट अल., 2015)। पैक्लिटैक्सेल प्रतिरोध जीन की पहचान करने के लिए, जीनोम-व्यापी sgRNA लाइब्रेरी स्क्रीनिंग के साथ RNA अनुक्रमण का उपयोग करके आठ संभावित जीनों की पहचान की गई, जिनमें हिस्टोन डीएसेटाइलेज 9 (HDAC9) भी शामिल है, जो बार-बार होने वाले TNBC (बी एट अल., 2020) के रोगियों में दवा प्रतिरोध से जुड़े हैं। एक अन्य अध्ययन में, कैंसर रोधी दवाओं से उपचारित TNBC रोगियों के जीवित रहने के दौरान डिसेरीन/थ्रेओनीन और टायरोसिन प्रोटीन काइनेज (DSTYK) की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति देखी गई। इसके अलावा, CRISPR/Cas9-मध्यस्थता द्वारा DSTYK के नॉकडाउन ने इन विट्रो (SUM102PT कोशिकाएं और MDA-MB-468 कोशिकाएं) और एक इन विवो TNBC मॉडल (ओगबू एट अल., 2021) में दवा प्रतिरोधी कैंसर कोशिकाओं के एपोप्टोसिस को काफी हद तक बढ़ाया।
हालांकि टीएनबीसी में एमएपीके मार्ग का असामान्य सक्रियण होता है, लेकिन एमईके-लक्षित उपचारों का नैदानिक ​​प्रभाव कमज़ोर है। एक CRISPR/Cas9 जीनोमिक लाइब्रेरी स्क्रीन से पता चला कि PSMG2 (प्रोटिओम असेंबली चैपरोन 2) का अवरोध टीएनबीसी BT549 और MB468 कोशिकाओं को एमईके अवरोधक AZD6244 के प्रति संवेदनशील बनाता है। CRISPR/Cas9 द्वारा PSMG2 के नॉकडाउन ने सामान्य प्रोटीसोम कार्य को बदल दिया, जिससे ऑटोफैगी-मध्यस्थता द्वारा PDPK1 का विघटन हुआ, जिसके परिणामस्वरूप AZD6244 (एमईके अवरोधक) और MG132 (प्रोटीसोम अवरोधक) द्वारा प्रेरित टीएनबीसी माउस मॉडल में ट्यूमर कोशिकाओं में और सुधार हुआ। इस प्रकार, ट्यूमर कोशिका प्रसार को कम करने के लिए प्रोटीसोम और मैप काइनेज (एमईके) अवरोधकों को सहक्रियात्मक रूप से प्रशासित किया जा सकता है (वांग एक्स. एट अल., 2022)।
CRISPR/Cas9 का उपयोग जीन कार्यक्षमता में कमी के कारण TNBC प्रतिरोध की जांच के लिए भी किया गया है (शू एट अल., 2020)। गे एट अल ने TNBC में JQ1, एक BET ब्रोमोडोमेन अवरोधक (BBDI), से उपचारित कैंसर कोशिकाओं के दवा प्रतिरोध की क्रियाविधि को समझाया। CRISPR/Cas9 का उपयोग करते हुए, उन्होंने पाया कि rb1 जीन को हटाने से TNBC कैंसर-रोधी दवा JQ1 के प्रति प्रतिरोधी हो जाता है। इसलिए, TNBC में JQ1 दवाओं की प्रतिक्रिया में rb1 की कार्यक्षमता महत्वपूर्ण है। उन्होंने यह भी बताया कि पैक्लिटैक्सेल एक CDK4/6 काइनेज/माइक्रोट्यूब्यूल अवरोधक है, और JQ1 जैसे BBDI के साथ इसका संयोजन दवा-प्रतिरोधी TNBC के लिए आशाजनक चिकित्सीय प्रतिक्रियाएँ प्रदान कर सकता है (गे एट अल., 2020)।
लंबे नॉनकोडिंग आरएनए (lncRNA) के ट्रांसक्रिप्शनल परिदृश्य को टीएनबीसी में नियोएडजुवेंट थेरेपी के प्रति प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार माना गया है। यह अध्ययन दर्शाता है कि पांच अलग-अलग MALAT1 lncRNA ट्रांसक्रिप्ट टीएनबीसी में उच्च स्तर पर व्यक्त होते हैं। इसके अतिरिक्त, CRISPR/Cas9-मध्यस्थता द्वारा MALAT1 के विलोपन से टीएनबीसी BT-549 कोशिकाओं की पैक्लिटैक्सेल और डॉक्सोरूबिसिन के प्रति संवेदनशीलता बढ़ गई, जो टीएनबीसी में MALAT1 प्रतिरोध की संभावित भूमिका का संकेत देती है (शाथ एट अल., 2021)।
BRCA1 (BRCA1m) में उत्परिवर्तन विषम होते हैं और इसलिए इनका पता लगाना कठिन होता है। BRCA1 के सिंथेटिक घातक सहयोगी PARP1 (पॉली(ADP-राइबोस) पॉलीमरेज़) को लक्षित करने से TNBC की दवा केमोसेंसिटिविटी बढ़ सकती है। CRISPR/Cas9 का उपयोग करके, PARP1 के विलोपन से mBRCA1 उत्परिवर्ती TNBC कोशिकाओं के प्रति डॉक्सोरूबिसिन, जेमिसिटाबाइन और डोसेटेक्सेल जैसी कैंसर-रोधी दवाओं की संवेदनशीलता बढ़ गई, जिससे पता चलता है कि PARP1 भी TNBC में दवा प्रतिरोध में शामिल है (वाघारी-तबारी एट अल., 2022)। ट्यूमर सप्रेसर जीन BRCA1 या BRCA2 में उत्परिवर्तन से लोगों में स्तन कैंसर विकसित होने की संभावना बढ़ जाती है। इन रोगियों के उपचार के लिए PARP अवरोधकों का उपयोग आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, यह प्रदर्शित किया गया है कि CRISPR/Cas9 का उपयोग करके न्यूक्लियोटाइड साल्वेज फैक्टर DNPH1 को निष्क्रिय करने से विषाक्त न्यूक्लियोटाइड 5-हाइड्रॉक्सीमेथिलडिऑक्सीयूरिडीन (hmdU) मोनोफॉस्फेट को हटाया जा सकता है, जिससे BRCA-कमी वाली कोशिकाओं की PARP अवरोधकों के प्रति संवेदनशीलता में वृद्धि होती है (फगर एट अल., 2021)। इस प्रकार, CRISPR/Cas9 और PARP1 अवरोधक TNBC के लिए एक महत्वपूर्ण उपचार रणनीति बन सकते हैं।
पेनिट्रेंट ग्लाइकोप्रोटीन (पी-जीपी) जीन एक बहु-दवा प्रतिरोध जीन है जो आमतौर पर सभी टीएनबीसी के लगभग 41% मामलों में अपग्रेड होता है (सन एट अल., 2020)। पी-जीपी-प्रेरित दवा बहिर्वाह को स्तन कैंसर में दवा प्रतिरोध के एक प्रमुख नियामक के रूप में पहचाना गया है। पी-जीपी अवरोधकों ने स्तन कैंसर में कैंसर-रोधी दवाओं के प्रति संवेदनशीलता में वृद्धि प्रदर्शित की है (फैमटा एट अल., 2021)। इस प्रकार, CRISPR/Cas9-मध्यस्थता द्वारा पी-जीपी और पी-जीपी अवरोधकों का उन्मूलन या दमन टीएनबीसी में दवा प्रतिरोध को दूर करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण तरीके हो सकते हैं।
एटीपी-बाइंडिंग कैसेट ट्रांसपोर्टर जी2 (एबीसीजी2) को टीएनबीसी में दवा प्रतिरोध का कारण माना जाता है (पालासुबर्नियम एट अल., 2015), हालांकि वर्तमान में सीआरआईएसपी/कैस9 और एबीसीजी2 साइलेंसिंग तथा ट्यूमर सप्रेसर जीन निष्क्रियता के बीच संबंध पर कोई रिपोर्ट नहीं है। पीटीईएन एबीसीजी2 सक्रियण को बढ़ा सकता है (पालासुबर्नियम एट अल., 2015), (दीपक सिंह एट अल., 2021)। इसलिए, एबीसीजी2 को हटाने के लिए सीआरआईएसपी/कैस9 का उपयोग करना और इसे एबीसीजी2 अवरोधक के साथ मिलाकर टीएनबीसी में दवा प्रतिरोध को दूर करने के लिए एक उपयुक्त उपचार हो सकता है। तालिका 2 में सीआरआईएसपी/कैस9 द्वारा लक्षित सभी प्रतिरोध जीनों का उल्लेख है।
तालिका 2. CRISPR/Cas9 विभिन्न TNBC प्रतिरोध जीनों को लक्षित करके कोशिकाओं को कैंसर रोधी दवाओं के प्रति संवेदनशील बनाता है।
CRISPR/Cas9 लाइब्रेरी कैंसर रोगजनन से जुड़े जीन उत्परिवर्तनों की स्क्रीनिंग के लिए संभावित उपकरण हैं (चान एट अल., 2022)। इस स्क्रीनिंग विधि में चार चरण शामिल हैं: (क) लाइब्रेरी निर्माण, (ख) लेंटिवाइरल ट्रांसडक्शन, (ग) फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग और (घ) लक्ष्य जीन विश्लेषण। हालांकि TNBC में MAPK मार्ग का असामान्य सक्रियण होता है, लेकिन PTEN, RB1 और TP53 जैसे ट्यूमर सप्रेसर जीन में उत्परिवर्तन वाले TNBC रोगियों के लिए MEK लक्षित थेरेपी का नैदानिक ​​पूर्वानुमान बहुत खराब है।
इसके अतिरिक्त, CRISPR/Cas9 का उपयोग करके किए गए जीन नॉकआउट परीक्षण में ग्वाटेमाला के फूलों और पत्तियों के अर्क में प्रचुर मात्रा में पाए जाने वाले सबसे शक्तिशाली और चयनात्मक अणु, डीहाइड्रोकैट्रोल का MDA-MB-231 पर प्रभाव समझने के लिए परीक्षण किया गया। चयनात्मक कोशिका विषाक्तता के तंत्र और TNBC उपप्रकारों की मेसेनकाइमल स्टेमनेस विशेषताओं का भी अध्ययन किया गया। इस CRISPR/Cas9-आधारित परीक्षण से यह भी पता चला कि HSD17B11, जो 17β-हाइड्रॉक्सीस्टेरॉइड डीहाइड्रोजनेज टाइप 11 को एन्कोड करने वाला जीन है, MDA-MB-231 कोशिकाओं में अत्यधिक मात्रा में व्यक्त होता है और इसके परिणामस्वरूप MDA-MB-231 कोशिकाओं के लिए विशिष्ट डीहाइड्रोफैल्कारिनोल बनता है (ग्रांट एट अल., 2020)। इस प्रकार, यह दर्शाता है कि CRISPR/Cas9 जीनोमिक स्क्रीनिंग में संभावित प्राकृतिक यौगिकों के कैंसर-रोधी गुणों के अंतर्निहित तंत्रों की पहचान करने की अपार क्षमता है।
इसके अतिरिक्त, निष्पक्ष जीनोम-व्यापी इन विवो CRISPR/Cas9 स्क्रीनिंग का उपयोग करके TNBC की कैंसर के प्रति संवेदनशीलता का अध्ययन किया गया, जिसने ऑन्कोजेनिक और ट्यूमर सप्रेसर मार्गों के बीच संबंध दिखाया। mTOR और Hippo मार्गों के प्रमुख घटकों को TNBC में ट्यूमर विनियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है। इसके अतिरिक्त, अध्ययनों से पता चला है कि mTORC1/2 और YAP ऑन्कोप्रोटीन का औषधीय अवरोध इन विट्रो ड्रग-मैट्रिक्स सिनर्जी मॉडल और इन विवो रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ़्ट का उपयोग करके TNBC की रोगजनकता को प्रभावी ढंग से रोकता है। इसके अलावा, टोरिन-1-मध्यस्थ mTORC1/2 अवरोध मैक्रोपीनोसाइटोसिस को बढ़ाता है, जबकि वर्टेपोर्फिन-प्रेरित YAP अवरोध TNBC कोशिका मृत्यु का कारण बनता है। कुल मिलाकर, ये परिणाम TNBC के लिए नए और प्रभावी उपचारों की पहचान करने के लिए जीनोम-व्यापी इन विवो CRISPR स्क्रीनिंग की शक्ति और मजबूती को उजागर करते हैं (Dai et al., 2021)।
प्रतिरक्षा प्रणाली का असंतुलन ट्यूमर के विकास में एक महत्वपूर्ण कारक है। कैंसर कोशिकाएं प्रतिरक्षा तंत्र को दरकिनार करके प्रतिरक्षा से बच निकलती हैं, जिनमें ट्यूमर के सूक्ष्म वातावरण में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिविधि में हस्तक्षेप करना और प्रतिरक्षा प्रणाली को कमजोर करना शामिल है। इसलिए, एक बेहतर प्रतिरक्षा प्रणाली विकसित करना ट्यूमर से लड़ने का एक प्रमुख तरीका हो सकता है। CRISPR/Cas9 आधारित जीन संशोधन का उपयोग प्रतिरक्षा प्रणाली की शिथिलता से संबंधित कई मुद्दों को विभिन्न दृष्टिकोणों से संबोधित करता है। CRISPR/Cas9 का उपयोग निम्नलिखित मार्गों (चित्र 3) के माध्यम से स्तन कैंसर के खिलाफ एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा को बेहतर बनाने के लिए किया गया है।
चित्र 3. CRISPR/Cas9 प्रतिरक्षा चिकित्सा TNBC कोशिकाओं को लक्षित करती है। CDK5 की कमी और PDL1 तथा CD155 के नॉकडाउन से प्रतिरक्षा प्रणाली मजबूत होती है। इसी प्रकार, A2AR की कमी और HER2, म्यूसिन 1 तथा TEM8 जैसे TAA के नॉकडाउन से कैंसर कोशिकाओं को नष्ट करने में CAR-T कोशिकाओं की दक्षता में वृद्धि होती है। CRISPR/Cas9 द्वारा संचालित T कोशिका स्क्रीनिंग से पता चला है कि p38 काइनेज का विघटन T कोशिकाओं की एंटीट्यूमर गतिविधि को बढ़ाता है। CRISPR/Cas9 द्वारा संशोधित T कोशिकाएं TCR (T कोशिका रिसेप्टर) की अभिव्यक्ति को बढ़ाती हैं, जिसके परिणामस्वरूप T कोशिकाओं में एंटीट्यूमर गतिविधि उत्पन्न होती है।
इम्यूनोथेरेपी का लक्ष्य प्रतिरक्षा प्रणाली को कैंसर कोशिकाओं पर हमला करने के लिए उत्तेजित करना है। इम्यून चेकपॉइंट प्रोटीन का अति-अभिव्यक्ति आमतौर पर स्वप्रतिरक्षित प्रतिक्रियाओं को रोकता है, लेकिन कैंसर को इनसे बचने में मदद कर सकता है (टोपालियन एट अल., 2015)। ये प्रोटीन प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सतह पर रिसेप्टर्स से जुड़कर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को रोकते हैं। कई चेकपॉइंट प्रोटीन (जैसे CD155 और PD-L1) प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर PD-1 रिसेप्टर को लक्षित करते हैं और स्तन कैंसर, विशेष रूप से TNBC में व्यक्त होते हैं (ली वाई-सी एट अल., 2020)। CRISPR/Cas9 का उपयोग करके PD-L1 या इसके रिसेप्टर को निष्क्रिय करने से प्रतिरक्षा प्रणाली को TNBC ट्यूमर पर हमला करने के लिए उत्तेजित किया जा सकता है (याहाता एट अल., 2019)। इसके अतिरिक्त, CRISPR/Cas9-मध्यस्थता द्वारा CDK5 के विलोपन के माध्यम से PD-L1 अभिव्यक्ति के डाउनरेगुलेशन को इन विट्रो और इन विवो में ट्यूमर के विकास को रोकने के लिए दिखाया गया है (डेंग एट अल., 2020)। स्तन कैंसर के इन विट्रो और इन विवो मॉडल में वृद्धि अवरोध से पता चलता है कि shRNA-मध्यस्थता द्वारा CD155 की कमी का स्तन कैंसर पर चिकित्सीय प्रभाव हो सकता है (गाओ एट अल., 2018)।
CAR T कोशिकाएं ट्यूमर-संबंधित प्रतिजनों (TAAs) को पहचानने वाले CARs को व्यक्त करती हैं और अपनी गतिविधि को बढ़ाने के लिए चेकपॉइंट प्रोटीन के नॉकडाउन का उपयोग कर सकती हैं (ली सी. एट अल., 2020)। स्तन कैंसर में CAR T कोशिका चिकित्सा के लिए विभिन्न संभावित लक्ष्य हैं, जिनमें HER2, म्यूसिन1 और TEM8 जैसे कई TAAs शामिल हैं (बजगेन एट अल., 2018)। इस बात के प्रमाण हैं कि मेसोथेलिन (TNBC BT-459 कोशिकाओं में अतिव्यक्त) को लक्षित करने वाली CAR T कोशिकाएं कैंसर के खिलाफ तब अधिक प्रभावी होती हैं जब CRISPR/Cas9 का उपयोग करके PD-1 को नॉकआउट किया जाता है (हू एट अल., 2019)। हालांकि, रोगियों से T कोशिकाओं को अलग करना और फिर उन्हें एक्स विवो संपादित करना एक श्रमसाध्य और समय लेने वाली प्रक्रिया है। हालांकि सार्वभौमिक टी कोशिकाएं अलगाव की आवश्यकताओं को कम कर सकती हैं, फिर भी ग्राफ्ट-बनाम-होस्ट असामान्यताओं को रोकने के लिए मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए) क्लास I और टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) व्यक्त करने वाली दाता टी कोशिकाओं को हटा दिया जाना चाहिए (रेन एट अल., 2017, 2017a)। CRISPR/Cas9 का उपयोग करके, HDR एक साथ TCR और HLA को समाप्त कर सकता है और CAR को एन्कोड करने वाले जीन को निष्क्रिय कर सकता है। अध्ययनों से पता चला है कि CRISPR/Cas9 का उपयोग एंटी-CD19 CARs को TCR लोकस में डालने के लिए किया जा सकता है, जिससे टी कोशिकाओं को कम किए बिना कुशलतापूर्वक CARs का उत्पादन किया जा सकता है (दिमित्री एट अल., 2022)। एलोजेनिक CAR टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए मल्टीप्लेक्स प्रौद्योगिकियां विकसित की गई हैं, जो एक साथ TCR, बीटा-2-माइक्रोग्लोबुलिन (B2M), HLA-I सबयूनिट और अन्य प्रोटीन जैसे PD-1 और CTLA-4 को समाप्त करती हैं, जिनमें अधिक कैंसर-रोधी गुण हो सकते हैं। टीएनबीसी के खिलाफ (आईक्वेम एट अल., 2017; लियू एट अल., 2017; रेन एट अल., 2017बी; दिमित्री एट अल., 2022)।
CRISPR/Cas9 का उपयोग CAR-T कोशिकाओं की प्रभावशीलता को बढ़ा सकता है। एडेनोसिन में प्रतिरक्षादमनकारी गुण होते हैं और यह T कोशिका क्रिया को अवरुद्ध करके तथा एडेनोसिन A2A रिसेप्टर्स (A2AR) को सक्रिय करके कैंसर-रोधी प्रतिरक्षा को कम कर सकता है (विगानो एट अल., 2019)। CRISPR/Cas9 का उपयोग करके A2AR को निष्क्रिय करने से शरीर में CAR-T कोशिकाओं की प्रभावशीलता में उल्लेखनीय सुधार हुआ (गिफ्रिडा एट अल., 2021)। T कोशिकाएं विभिन्न फेनोटाइपिक विशेषताओं जैसे कि कोशिकीय विस्तार, विभेदन, ऑक्सीडेटिव तनाव और जीनोमिक तनाव प्रदर्शित करती हैं। CRISPR/Cas9-आधारित T कोशिका स्क्रीनिंग से 25 विभिन्न T कोशिका रिसेप्टर किनेज के विघटन का पता चला। इनमें से, p38 किनेज के विलोपन से T कोशिकाओं की एंटीट्यूमर गतिविधि में वृद्धि देखी गई है, जो दर्शाता है कि p38 किनेज CAR-T कोशिका विनियमन का एक प्रमुख नियामक है (गुरुसामी एट अल., 2020)।
CRISPR/Cas9 का उपयोग करके T कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है ताकि उच्च स्तर पर व्यक्त TCRs का उत्पादन हो सके। आनुवंशिक रूप से संशोधित T कोशिकाओं को रोगियों में स्थानांतरित करने से अंतर्जात T कोशिकाओं की तुलना में अधिक मजबूत कैंसर-रोधी गतिविधि देखी गई है। इसलिए, अंतर्जात TCRs रोगियों में आनुवंशिक रूप से परिवर्तित TCRs के साथ प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं, जिससे कैंसर प्रतिरक्षा चिकित्सा की क्षमता प्रभावित हो सकती है। इस समस्या को दूर करने के लिए, प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में अंतर्जात TCR-β को हटाने के लिए CRISPR/Cas9 का उपयोग करना और बाद में TCR-β T कोशिकाओं को कैंसर रोगियों में स्थानांतरित करना अंतर्जात TCR यौन प्रतिस्पर्धा की आवश्यकता के बिना बेहतर कैंसर-रोधी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रदर्शित कर सकता है (फैन एट अल. 2018)। इस प्रकार, CRISPR-संशोधित T कोशिकाओं को छोड़कर, TCRs सामान्य TCR-ट्रांसड्यूस्ड T कोशिकाओं की तुलना में ट्यूमर प्रतिजनों के प्रति हजार गुना अधिक संवेदनशील होते हैं। इसके अतिरिक्त, विभिन्न ल्यूकेमिया में, γδ TCR+ CRISPR द्वारा उत्पन्न परिवर्तित T कोशिकाएं मानक TCR स्थानांतरण की तुलना में CD4+ और CD8+ T कोशिकाओं की उच्च अभिव्यक्ति प्रदर्शित करती हैं (लेगुट एट अल., 2018)। इस प्रकार, CRISPR/Cas9 द्वारा उत्पन्न संशोधित T कोशिकाएं TNBC पर काबू पाने के लिए एक प्रभावी प्रतिरक्षा चिकित्सा विधि हो सकती हैं।
इंटीग्रिन कोशिका आसंजन अणु होते हैं जो कोशिकीय झिल्ली में मौजूद होते हैं और कोशिकाओं को बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) से बांधने में सहायक होते हैं (हामिदी और इवास्का, 2018)। इंटीग्रिन का अविनियमन बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स में परिवर्तन करके कैंसर के विकास और प्रसार से जुड़ा होता है, जिससे परिसंचरण में कैंसर कोशिकाओं का अस्तित्व बना रहता है (हामिदी और इवास्का, 2018)। CRISPR/Cas9-मध्यस्थता द्वारा इंटीग्रिन नॉकडाउन, TNBC में ट्यूमर की प्रगति, मेटास्टेसिस और उपनिवेशीकरण को धीमा कर देता है। इंटीग्रिन a5 (ITGA5) के नॉकडाउन से फेफड़ों के कैंसर जैसे अन्य कैंसर में कोशिका प्रवास और प्रगति में कमी देखी गई है (जू एट अल., 2017), जिससे पता चलता है कि इंटीग्रिन a5 भी TNBC के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण कारक हो सकता है।
परंपरागत भ्रूण स्टेम (ES) कोशिका विधियों का उपयोग करके नॉकआउट चूहे बनाना एक श्रमसाध्य, समय लेने वाली और अक्षम प्रक्रिया है। समरूप पुनर्संयोजन के माध्यम से ES कोशिकाओं को लक्षित करने, काइमेरिक चूहों का प्रजनन करने और फिर समरूप संतान उत्पन्न करने के लिए उन्हें विषमयुग्मजी चूहों के साथ संकरण कराने में महीनों और वर्षों का समय लगता है। कई आनुवंशिक उत्परिवर्तन वाले चूहे बनाने के लिए जटिल संकरण की आवश्यकता होती है। हालांकि, CRISPR/Cas9 का उपयोग करके ES कोशिकाओं के विलोपन द्वारा या एकल-कोशिका निषेचित अंडों में CRISPR/Cas9 घटकों को सूक्ष्म इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न चूहों का उपयोग करते समय कई समस्याएं उत्पन्न हुई हैं। उदाहरण के लिए, परिवर्तन अक्सर द्विएलिलिक लोकी पर होते हैं और जीन विशिष्ट नहीं होते हैं। हाल ही में यह बताया गया है कि CRISPR/Cas9 तकनीक का उपयोग करने वाली ES कोशिकाएं एक साथ 5 जीनों तक में द्विएलिलिक उत्परिवर्तन सम्मिलित कर सकती हैं (निशिज़ोनो एट अल., 2021)। इस उद्देश्य के लिए, Cas9 mRNA और पांच जीन-विशिष्ट gRNA को एक साथ ES कोशिकाओं में प्रत्यारोपित किया गया। यह प्रक्रिया की क्षमता और प्रभावशीलता को उजागर करता है, हालांकि ये उत्परिवर्तन संस्थापक वंशों के प्रजनन के दौरान पांच गुना नॉकआउट चूहों के उत्पादन में भी स्थानांतरित हो सकते हैं। अध्ययन में एक आश्चर्यजनक खोज भी सामने आई है: आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहे बनाने के लिए अब ES कोशिकाओं की आवश्यकता नहीं है। इसके बजाय, विशिष्ट जीन उत्पादों को हटाने के लिए, Cas9 mRNA और gRNA को एकल-कोशिका अवस्था के भ्रूणों में इंजेक्ट किया गया। परिणामस्वरूप, नॉकआउट संस्थापक वंश बनाए गए हैं जिनका सैद्धांतिक रूप से चूहों में जीन विलोपन के परिणामों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है (किन एट अल., 2016)। इस प्रकार, CRISPR/Cas9 पारंपरिक आनुवंशिक इंजीनियरिंग की तुलना में कम लागत पर TNBC के उपचार के लिए ट्रांसजेनिक चूहे बनाने की अनुमति देता है। CRISPR/Cas प्रणाली का उपयोग करके, एक नया नॉकआउट चूहा मॉडल विकसित किया गया है जो TNBC में एक या अधिक अंतर्जात जीनों में बिंदु उत्परिवर्तन को सफलतापूर्वक उत्पन्न कर सकता है। इस अवधारणा के आधार पर, BRCA1 और p53 के CRISPR/Cas9-मध्यस्थ विलोपन का उपयोग करके TNBC के पशु मॉडल भी विकसित किए जा सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप HR मरम्मत का नुकसान, जीनोमिक अस्थिरता और उत्परिवर्ती फेनोटाइप (Annunziato et al., 2020) होता है।
वर्तमान में, स्तन कैंसर (टीएनबीसी) के निदान के लिए मैमोग्राफी, मैग्नेटिक रेजोनेंस इमेजिंग (एमआरआई) और अल्ट्रासाउंड जैसी विभिन्न विधियों का उपयोग किया जाता है। हालांकि, इन विधियों की कुछ सीमाएँ हैं। मैमोग्राफी का उपयोग स्तन के स्थानीय ऊतकों के निदान के लिए किया जाता है, न कि मेटास्टेसिस के लिए, जहाँ कैंसर कोशिकाएँ अन्य अंगों में फैल चुकी होती हैं। अल्ट्रासोनोग्राफी टीएनबीसी के निदान के लिए एक विश्वसनीय विधि नहीं है (चेन और ली-फेलकर, 2023)। एमआरआई की संवेदनशीलता अल्ट्रासाउंड और मैमोग्राफी से अधिक है, लेकिन इसकी नैदानिक ​​सटीकता सीमित है (शा और चेन, 2022)। ऊतक बायोप्सी कैंसर कोशिकाओं की पहचान करने का एक आक्रामक तरीका है। हालांकि, कुछ मामलों में, यदि सुई इच्छित क्षेत्र से भटक जाती है, तो बायोप्सी में कैंसरयुक्त ऊतक छूट सकता है। इसके अलावा, यह बहुत महंगा है और रोगी के लिए कष्टदायक हो सकता है। टीएनबीसी एक विषम प्रकार का कैंसर है, इसलिए बायोप्सी कैंसर के प्रकार के बारे में पर्याप्त जानकारी प्रदान नहीं कर सकती है। इसलिए, टीएनबीसी का पता लगाने के लिए एक नई, नैदानिक ​​रूप से विश्वसनीय विधि की तत्काल आवश्यकता है। CRISPR/Cas9 स्तन कैंसर के निदान के लिए एक अत्यंत संवेदनशील और न्यूनतम आक्रामक विकल्प के रूप में काम कर सकता है। इस उद्देश्य से, TNBC के निदान के लिए PCR विधियों को बेहतर बनाने हेतु CRISPR/Cas9-आधारित रणनीतियों का उपयोग किया जा सकता है। सबसे पहले, CRISPR प्रणाली के Cas9 और cpf1 प्रोटीन का उपयोग गैर-विशिष्ट DNA को हटाने के लिए किया जाता है, और फिर ये दोनों प्रोटीन (Cas9 और cpf1) लक्ष्य DNA से जुड़ने से पहले PAM अनुक्रम को पहचान सकते हैं (दीपक सिंह एट अल., 2021)। इस प्रकार, PCR कैंसर के विकास से जुड़े उत्परिवर्तनों की पहचान कर सकता है। कई अध्ययनों ने विभिन्न कैंसरों में विभिन्न उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए इस CRISPR-आधारित रणनीति को अपनाया है (सफारी एट अल., 2019)। इस प्रकार, CRISPR-आधारित PCR विधियाँ TNBC निदान की बायोप्सी-आधारित इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जैसी आक्रामक विधियों पर निर्भरता को कम कर सकती हैं।
टीएनबीसी में हार्मोन रिसेप्टर विनियमन में जीनोटाइपिक परिवर्तन भी प्रदर्शित किए गए हैं (चेन और रूसो, 2009)। पॉइंट-ऑफ-केयर डायग्नोस्टिक्स के लिए माइक्रोएरे का उपयोग करते हुए CRISPR/Cas9-आधारित पीसीआर रणनीतियाँ इन उत्परिवर्तनों की प्रभावी ढंग से निगरानी कर सकती हैं (हाजियान एट अल., 2019)। यह स्वास्थ्य सेवा प्रदाताओं को टीएनबीसी रोगियों में विशिष्ट उत्परिवर्तनों के बारे में प्रासंगिक जानकारी भी प्रदान कर सकता है, जिससे उनके उपचार में सुधार करने में मदद मिल सकती है। हालांकि, इस संयुक्त तकनीक की कुछ सीमाएँ हैं। इसलिए, टीएनबीसी के निदान के लिए स्वास्थ्य सेवा में इस CRISPR/Cas-पीसीआर विधि का उपयोग करने से पहले व्यापक शोध प्रयासों की आवश्यकता है (यांग एट अल., 2019)।