मेटाबोलॉमिक्स रोगी सीरम के उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण का उपयोग करके उच्च विशिष्टता के साथ सौम्य और घातक फुफ्फुसीय नोड्यूल को अलग करता है।

कंप्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी) द्वारा पहचाने गए फुफ्फुसीय नोड्यूल का विभेदक निदान नैदानिक ​​​​अभ्यास में एक चुनौती बना हुआ है।यहां, हम 480 सीरम नमूनों के वैश्विक चयापचय की विशेषता बताते हैं, जिसमें स्वस्थ नियंत्रण, सौम्य फेफड़े के नोड्यूल और चरण I फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा शामिल हैं।एडेनोकार्सिनोमा अद्वितीय चयापचय प्रोफाइल प्रदर्शित करता है, जबकि सौम्य नोड्यूल और स्वस्थ व्यक्तियों में चयापचय प्रोफाइल में उच्च समानता होती है।खोज समूह (एन = 306) में, सौम्य और घातक नोड्यूल के बीच अंतर करने के लिए 27 मेटाबोलाइट्स के एक सेट की पहचान की गई थी।आंतरिक सत्यापन (एन = 104) और बाहरी सत्यापन (एन = 111) समूहों में विभेदक मॉडल का एयूसी क्रमशः 0.915 और 0.945 था।पाथवे विश्लेषण से पता चला कि सौम्य नोड्यूल और स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा सीरम में ट्रिप्टोफैन में कमी के साथ जुड़े ग्लाइकोलाइटिक मेटाबोलाइट्स में वृद्धि हुई है, और सुझाव दिया गया है कि ट्रिप्टोफैन का सेवन फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं में ग्लाइकोलाइसिस को बढ़ावा देता है।हमारा अध्ययन सीटी द्वारा पता लगाए गए फुफ्फुसीय नोड्यूल के जोखिम का आकलन करने में सीरम मेटाबोलाइट बायोमार्कर के मूल्य पर प्रकाश डालता है।
कैंसर रोगियों की जीवित रहने की दर में सुधार के लिए शीघ्र निदान महत्वपूर्ण है।यूएस नेशनल लंग कैंसर स्क्रीनिंग ट्रायल (एनएलएसटी) और यूरोपीय नेल्सन अध्ययन के परिणामों से पता चला है कि कम खुराक वाली कंप्यूटेड टोमोग्राफी (एलडीसीटी) के साथ स्क्रीनिंग उच्च जोखिम वाले समूहों1,2,3 में फेफड़ों के कैंसर की मृत्यु दर को काफी कम कर सकती है।फेफड़ों के कैंसर की जांच के लिए एलडीसीटी के व्यापक उपयोग के बाद से, स्पर्शोन्मुख फुफ्फुसीय नोड्यूल के आकस्मिक रेडियोग्राफिक निष्कर्षों की घटनाओं में वृद्धि जारी है।पल्मोनरी नोड्यूल्स को 3 सेमी व्यास 5 तक की फोकल अपारदर्शिता के रूप में परिभाषित किया गया है।हमें दुर्दमता की संभावना का आकलन करने और एलडीसीटी पर संयोगवश बड़ी संख्या में पाए गए फुफ्फुसीय नोड्यूल से निपटने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है।सीटी की सीमाएं बार-बार अनुवर्ती परीक्षाओं और गलत-सकारात्मक परिणामों को जन्म दे सकती हैं, जिससे अनावश्यक हस्तक्षेप और अत्यधिक उपचार हो सकता है।इसलिए, शुरुआती चरणों में फेफड़ों के कैंसर की सही पहचान करने और प्रारंभिक पहचान 7 में सबसे सौम्य नोड्यूल को अलग करने के लिए विश्वसनीय और उपयोगी बायोमार्कर विकसित करने की आवश्यकता है।
जीनोमिक्स, प्रोटिओमिक्स या डीएनए मिथाइलेशन8,9,10 सहित रक्त (सीरम, प्लाज्मा, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं) के व्यापक आणविक विश्लेषण ने फेफड़ों के कैंसर के लिए नैदानिक ​​​​बायोमार्कर की खोज में रुचि बढ़ाई है।इस बीच, मेटाबोलॉमिक्स दृष्टिकोण सेलुलर अंत उत्पादों को मापता है जो अंतर्जात और बहिर्जात क्रियाओं से प्रभावित होते हैं और इसलिए रोग की शुरुआत और परिणाम की भविष्यवाणी करने के लिए लागू होते हैं।लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) अपनी उच्च संवेदनशीलता और बड़ी गतिशील रेंज के कारण मेटाबोलॉमिक्स अध्ययन के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है, जो विभिन्न भौतिक रासायनिक गुणों वाले मेटाबोलाइट्स को कवर कर सकती है।यद्यपि प्लाज्मा/सीरम के वैश्विक मेटाबॉलिक विश्लेषण का उपयोग फेफड़ों के कैंसर निदान14,15,16,17 और उपचार प्रभावकारिता से जुड़े बायोमार्कर की पहचान करने के लिए किया गया है, सौम्य और घातक फेफड़ों के नोड्यूल के बीच अंतर करने के लिए 18 सीरम मेटाबोलाइट क्लासिफायर का अभी भी बहुत अध्ययन किया जा रहा है।-बड़े पैमाने पर शोध.
एडेनोकार्सिनोमा और स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा गैर-लघु कोशिका फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी) के दो मुख्य उपप्रकार हैं।विभिन्न सीटी स्क्रीनिंग परीक्षणों से संकेत मिलता है कि एडेनोकार्सिनोमा फेफड़ों के कैंसर का सबसे आम हिस्टोलॉजिकल प्रकार है1,19,20,21।इस अध्ययन में, हमने स्वस्थ नियंत्रण, सौम्य फुफ्फुसीय नोड्यूल और सीटी-पता लगाए गए ≤3 सेमी सहित कुल 695 सीरम नमूनों पर मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण करने के लिए अल्ट्रा-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (यूपीएलसी-एचआरएमएस) का उपयोग किया।स्टेज I फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के लिए स्क्रीनिंग।हमने सीरम मेटाबोलाइट्स के एक पैनल की पहचान की है जो फेफड़ों के एडेनोकार्सिनोमा को सौम्य नोड्यूल और स्वस्थ नियंत्रण से अलग करता है।पाथवे संवर्धन विश्लेषण से पता चला कि असामान्य ट्रिप्टोफैन और ग्लूकोज चयापचय सौम्य नोड्यूल और स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा में आम परिवर्तन हैं।अंत में, हमने एलडीसीटी द्वारा पता लगाए गए घातक और सौम्य फुफ्फुसीय नोड्यूल के बीच अंतर करने के लिए उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता के साथ एक सीरम मेटाबोलिक क्लासिफायरियर की स्थापना और सत्यापन किया, जो प्रारंभिक विभेदक निदान और जोखिम मूल्यांकन में सहायता कर सकता है।
वर्तमान अध्ययन में, लिंग और आयु-मिलान वाले सीरम के नमूने 174 स्वस्थ नियंत्रणों, सौम्य फुफ्फुसीय नोड्यूल वाले 292 रोगियों और चरण I फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा वाले 229 रोगियों से पूर्वव्यापी रूप से एकत्र किए गए थे।695 विषयों की जनसांख्यिकीय विशेषताओं को पूरक तालिका 1 में दिखाया गया है।
जैसा कि चित्र 1ए में दिखाया गया है, सन यात-सेन यूनिवर्सिटी कैंसर सेंटर में 174 स्वस्थ नियंत्रण (एचसी), 170 सौम्य नोड्यूल (बीएन), और 136 चरण I फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा (एलए) नमूनों सहित कुल 480 सीरम नमूने एकत्र किए गए थे।अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-हाई-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (यूपीएलसी-एचआरएमएस) का उपयोग करके अलक्षित मेटाबॉलिक प्रोफाइलिंग के लिए डिस्कवरी कोहोर्ट।जैसा कि पूरक चित्र 1 में दिखाया गया है, एलए और एचसी, एलए और बीएन के बीच अंतर मेटाबोलाइट्स की पहचान एक वर्गीकरण मॉडल स्थापित करने और आगे अंतर मार्ग विश्लेषण का पता लगाने के लिए की गई थी।सन यात-सेन यूनिवर्सिटी कैंसर सेंटर द्वारा एकत्र किए गए 104 नमूने और दो अन्य अस्पतालों द्वारा एकत्र किए गए 111 नमूने क्रमशः आंतरिक और बाहरी सत्यापन के अधीन थे।
डिस्कवरी समूह में एक अध्ययन आबादी जिसने अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-हाई-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (यूपीएलसी-एचआरएमएस) का उपयोग करके वैश्विक सीरम मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण किया।बी अध्ययन समूह के 480 सीरम नमूनों के कुल चयापचय का आंशिक न्यूनतम वर्ग विभेदक विश्लेषण (पीएलएस-डीए), जिसमें स्वस्थ नियंत्रण (एचसी, एन = 174), सौम्य नोड्यूल्स (बीएन, एन = 170), और चरण I फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा शामिल हैं। (लॉस एंजिल्स, एन = 136)।+ईएसआई, सकारात्मक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मोड, -ईएसआई, नकारात्मक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मोड।सी-ई दो दिए गए समूहों (दो-पूंछ वाले विलकॉक्सन हस्ताक्षरित रैंक परीक्षण, गलत खोज दर समायोजित पी मान, एफडीआर <0.05) में महत्वपूर्ण रूप से भिन्न प्रचुरता वाले मेटाबोलाइट्स को लाल (गुना परिवर्तन> 1.2) और नीले (गुना परिवर्तन <0.83) में दिखाया गया है। .) ज्वालामुखी ग्राफ़िक पर दिखाया गया है।एफ पदानुक्रमित क्लस्टरिंग हीट मैप एलए और बीएन के बीच एनोटेटेड मेटाबोलाइट्स की संख्या में महत्वपूर्ण अंतर दिखा रहा है।स्रोत डेटा स्रोत डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रदान किया जाता है।
खोज समूह में 174 एचसी, 170 बीएन और 136 एलए के कुल सीरम चयापचय का यूपीएलसी-एचआरएमएस विश्लेषण का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था।हम पहले दिखाते हैं कि गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) नमूने एक अनसुपरवाइज्ड प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस (पीसीए) मॉडल के केंद्र में कसकर क्लस्टर करते हैं, जो वर्तमान अध्ययन के प्रदर्शन की स्थिरता की पुष्टि करता है (पूरक चित्रा 2)।
जैसा कि चित्र 1 बी में आंशिक न्यूनतम वर्ग-विभेदक विश्लेषण (पीएलएस-डीए) में दिखाया गया है, हमने पाया कि सकारात्मक (+ईएसआई) और नकारात्मक (−ईएसआई) इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मोड में एलए और बीएन, एलए और एचसी के बीच स्पष्ट अंतर थे। .एकाकी।हालाँकि, +ESI और -ESI स्थितियों में BN और HC के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया।
हमें एलए और एचसी के बीच 382 अंतर विशेषताएं, एलए और बीएन के बीच 231 अंतर विशेषताएं, और बीएन और एचसी के बीच 95 अंतर विशेषताएं मिलीं (विलकॉक्सन हस्ताक्षरित रैंक परीक्षण, एफडीआर <0.05 और एकाधिक परिवर्तन>1.2 या <0.83) (चित्र.1सी-ई) )..चोटियों को एक डेटाबेस (mzCloud/HMDB/Chemspider लाइब्रेरी) के विरुद्ध m/z मान, अवधारण समय और विखंडन द्रव्यमान स्पेक्ट्रम खोज (तरीके अनुभाग में वर्णित विवरण) 22 द्वारा आगे एनोटेट किया गया (पूरक डेटा 3)।अंत में, बहुतायत में महत्वपूर्ण अंतर वाले 33 और 38 एनोटेटेड मेटाबोलाइट्स को क्रमशः एलए बनाम बीएन (चित्रा 1 एफ और अनुपूरक तालिका 2) और एलए बनाम एचसी (पूरक चित्रा 3 और अनुपूरक तालिका 2) के लिए पहचाना गया।इसके विपरीत, पीएलएस-डीए में बीएन और एचसी के बीच ओवरलैप के अनुरूप, बीएन और एचसी (पूरक तालिका 2) में प्रचुर मात्रा में महत्वपूर्ण अंतर वाले केवल 3 मेटाबोलाइट्स की पहचान की गई थी।ये विभेदक मेटाबोलाइट्स जैव रसायनों की एक विस्तृत श्रृंखला को कवर करते हैं (पूरक चित्र 4)।एक साथ लेने पर, ये परिणाम सीरम चयापचय में महत्वपूर्ण परिवर्तन दर्शाते हैं जो सौम्य फेफड़े के नोड्यूल या स्वस्थ विषयों की तुलना में प्रारंभिक चरण के फेफड़ों के कैंसर के घातक परिवर्तन को दर्शाते हैं।इस बीच, बीएन और एचसी के सीरम चयापचय की समानता से पता चलता है कि सौम्य फुफ्फुसीय नोड्यूल स्वस्थ व्यक्तियों के साथ कई जैविक विशेषताओं को साझा कर सकते हैं।यह देखते हुए कि एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) जीन उत्परिवर्तन फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा उपप्रकार 23 में आम हैं, हमने सीरम चयापचय पर चालक उत्परिवर्तन के प्रभाव को निर्धारित करने की मांग की।फिर हमने फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा समूह में ईजीएफआर स्थिति वाले 72 मामलों के समग्र चयापचय प्रोफ़ाइल का विश्लेषण किया।दिलचस्प बात यह है कि हमें पीसीए विश्लेषण (पूरक चित्रा 5 ए) में ईजीएफआर उत्परिवर्ती रोगियों (एन = 41) और ईजीएफआर जंगली-प्रकार के रोगियों (एन = 31) के बीच तुलनीय प्रोफाइल मिला।हालाँकि, हमने 7 मेटाबोलाइट्स की पहचान की, जिनकी प्रचुरता जंगली प्रकार के ईजीएफआर (टी परीक्षण, पी <0.05 और गुना परिवर्तन> 1.2 या <0.83) (पूरक चित्रा 5 बी) वाले रोगियों की तुलना में ईजीएफआर उत्परिवर्तन वाले रोगियों में काफी बदल गई थी।इन मेटाबोलाइट्स में से अधिकांश (7 में से 5) एसाइलकार्निटाइन हैं, जो फैटी एसिड ऑक्सीकरण मार्गों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।
जैसा कि चित्र 2 ए में दिखाए गए वर्कफ़्लो में दिखाया गया है, नोड्यूल वर्गीकरण के लिए बायोमार्कर कम से कम पूर्ण संकोचन ऑपरेटरों का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे और एलए (एन = 136) और बीएन (एन = 170) में पहचाने गए 33 विभेदक मेटाबोलाइट्स के आधार पर चयन किया गया था।चरों का सर्वोत्तम संयोजन (LASSO) - बाइनरी लॉजिस्टिक रिग्रेशन मॉडल।मॉडल की विश्वसनीयता का परीक्षण करने के लिए दस-गुना क्रॉस-सत्यापन का उपयोग किया गया था।परिवर्तनीय चयन और पैरामीटर नियमितीकरण को पैरामीटर λ24 के साथ संभावना अधिकतमकरण दंड द्वारा समायोजित किया जाता है।विभेदक मॉडल के वर्गीकरण प्रदर्शन का परीक्षण करने के लिए वैश्विक चयापचय विश्लेषण को आंतरिक सत्यापन (एन = 104) और बाहरी सत्यापन (एन = 111) समूहों में स्वतंत्र रूप से किया गया था।परिणामस्वरूप, खोज सेट में 27 मेटाबोलाइट्स को सबसे बड़े औसत एयूसी मूल्य (छवि 2 बी) के साथ सबसे अच्छे विभेदक मॉडल के रूप में पहचाना गया, जिनमें से 9 में बीएन (छवि 2 सी) की तुलना में एलए में गतिविधि में वृद्धि हुई और 18 में कमी आई।
दस-गुना क्रॉस-वैलिडेशन के माध्यम से बाइनरी लॉजिस्टिक रिग्रेशन मॉडल का उपयोग करके डिस्कवरी सेट में सीरम मेटाबोलाइट्स के सर्वश्रेष्ठ पैनल का चयन करना और आंतरिक और बाहरी सत्यापन सेट में पूर्वानुमानित प्रदर्शन का मूल्यांकन करना शामिल है।बी चयापचय बायोमार्कर चयन के लिए LASSO प्रतिगमन मॉडल के क्रॉस-सत्यापन आँकड़े।ऊपर दी गई संख्याएं किसी दिए गए λ पर चयनित बायोमार्कर की औसत संख्या दर्शाती हैं।लाल बिंदीदार रेखा संबंधित लैम्ब्डा पर औसत एयूसी मान का प्रतिनिधित्व करती है।ग्रे त्रुटि पट्टियाँ न्यूनतम और अधिकतम AUC मान दर्शाती हैं।बिंदीदार रेखा 27 चयनित बायोमार्कर के साथ सर्वोत्तम मॉडल को इंगित करती है।एयूसी, रिसीवर ऑपरेटिंग विशेषता (आरओसी) वक्र के तहत क्षेत्र।सी खोज समूह में बीएन समूह की तुलना में एलए समूह में 27 चयनित मेटाबोलाइट्स के परिवर्तन को मोड़ें।लाल स्तंभ - सक्रियण.नीला स्तम्भ गिरावट है.डी-एफ रिसीवर ऑपरेटिंग विशेषता (आरओसी) वक्र खोज, आंतरिक और बाहरी सत्यापन सेट में 27 मेटाबोलाइट संयोजनों के आधार पर विभेदक मॉडल की शक्ति दिखाता है।स्रोत डेटा स्रोत डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रदान किया जाता है।
इन 27 मेटाबोलाइट्स (पूरक तालिका 3) के भारित प्रतिगमन गुणांक के आधार पर एक भविष्यवाणी मॉडल बनाया गया था।इन 27 मेटाबोलाइट्स के आधार पर आरओसी विश्लेषण से 0.933 के वक्र (एयूसी) मूल्य के तहत एक क्षेत्र प्राप्त हुआ, खोज समूह संवेदनशीलता 0.868 थी, और विशिष्टता 0.859 थी (छवि 2 डी)।इस बीच, एलए और एचसी के बीच 38 एनोटेटेड अंतर मेटाबोलाइट्स में से, 16 मेटाबोलाइट्स के एक सेट ने 0.801 की संवेदनशीलता के साथ 0.902 का एयूसी और एचसी से एलए को भेदभाव करने में 0.856 की विशिष्टता हासिल की (पूरक चित्रा 6 ए-सी)।विभेदक मेटाबोलाइट्स के लिए अलग-अलग गुना परिवर्तन थ्रेसहोल्ड के आधार पर एयूसी मूल्यों की भी तुलना की गई।हमने पाया कि वर्गीकरण मॉडल ने एलए और बीएन (एचसी) के बीच भेदभाव करने में सबसे अच्छा प्रदर्शन किया जब गुना परिवर्तन स्तर 1.2 बनाम 1.5 या 2.0 पर सेट किया गया था (पूरक चित्रा 7 ए, बी)।27 मेटाबोलाइट समूहों पर आधारित वर्गीकरण मॉडल को आंतरिक और बाह्य समूहों में आगे मान्य किया गया था।आंतरिक सत्यापन के लिए एयूसी 0.915 (संवेदनशीलता 0.867, विशिष्टता 0.811) और बाहरी सत्यापन के लिए 0.945 (संवेदनशीलता 0.810, विशिष्टता 0.979) थी (चित्र 2ई, एफ)।अंतरप्रयोगशाला दक्षता का आकलन करने के लिए, बाहरी समूह से 40 नमूनों का एक बाहरी प्रयोगशाला में विश्लेषण किया गया जैसा कि विधि अनुभाग में वर्णित है।वर्गीकरण सटीकता ने 0.925 का एयूसी हासिल किया (पूरक चित्र 8)।चूँकि फेफड़े का स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (LUSC) फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा (LUAD) के बाद गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) का दूसरा सबसे आम उपप्रकार है, इसलिए हमने चयापचय प्रोफाइल की मान्य संभावित उपयोगिता का भी परीक्षण किया।बीएन और एलयूएससी के 16 मामले।एलयूएससी और बीएन के बीच भेदभाव का एयूसी 0.776 था (पूरक चित्र 9), जो एलयूएडी और बीएन के बीच भेदभाव की तुलना में खराब क्षमता को दर्शाता है।
अध्ययनों से पता चला है कि सीटी छवियों पर नोड्यूल्स का आकार घातकता की संभावना के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध है और नोड्यूल उपचार का एक प्रमुख निर्धारक बना हुआ है।नेल्सन स्क्रीनिंग अध्ययन के बड़े समूह के डेटा के विश्लेषण से पता चला कि नोड्स <5 मिमी वाले विषयों में घातकता का जोखिम बिना नोड्स 28 वाले विषयों के समान था।इसलिए, नियमित सीटी निगरानी की आवश्यकता वाला न्यूनतम आकार 5 मिमी है, जैसा कि ब्रिटिश थोरैसिक सोसाइटी (बीटीएस) द्वारा अनुशंसित है, और 6 मिमी, जैसा कि फ़्लिशनर सोसाइटी 29 द्वारा अनुशंसित है।हालाँकि, 6 मिमी से बड़े और बिना स्पष्ट सौम्य विशेषताओं वाले नोड्यूल, जिन्हें अनिश्चित फुफ्फुसीय नोड्यूल (आईपीएन) कहा जाता है, नैदानिक ​​​​अभ्यास 30,31 में मूल्यांकन और प्रबंधन में एक बड़ी चुनौती बने हुए हैं।हमने अगली जांच की कि क्या नोड्यूल आकार ने खोज और आंतरिक सत्यापन समूहों से एकत्रित नमूनों का उपयोग करके मेटाबोलॉमिक हस्ताक्षरों को प्रभावित किया है।27 मान्य बायोमार्कर पर ध्यान केंद्रित करते हुए, हमने सबसे पहले एचसी और बीएन सब-6 मिमी मेटाबॉलिज्म के पीसीए प्रोफाइल की तुलना की।हमने पाया कि एचसी और बीएन के लिए अधिकांश डेटा बिंदु ओवरलैप हो गए, यह दर्शाता है कि सीरम मेटाबोलाइट का स्तर दोनों समूहों में समान था (चित्र 3 ए)।विभिन्न आकार श्रेणियों में फीचर मानचित्र बीएन और एलए (छवि 3 बी, सी) में संरक्षित रहे, जबकि 6-20 मिमी रेंज (छवि 3 डी) में घातक और सौम्य नोड्यूल के बीच एक अलगाव देखा गया था।इस समूह में 0.927 का एयूसी, 0.868 की विशिष्टता और 6 से 20 मिमी मापने वाले नोड्यूल्स की घातकता की भविष्यवाणी करने के लिए 0.820 की संवेदनशीलता थी (चित्र 3ई, एफ)।हमारे नतीजे बताते हैं कि क्लासिफायरियर नोड्यूल आकार की परवाह किए बिना प्रारंभिक घातक परिवर्तन के कारण होने वाले चयापचय परिवर्तनों को पकड़ सकता है।
विज्ञापन 27 मेटाबोलाइट्स के चयापचय वर्गीकरण के आधार पर निर्दिष्ट समूहों के बीच पीसीए प्रोफाइल की तुलना।सीसी और बीएन <6 मिमी।बी बीएन <6 मिमी बनाम बीएन 6-20 मिमी।एलए में 6-20 मिमी बनाम एलए 20-30 मिमी में।जी बीएन 6-20 मिमी और एलए 6-20 मिमी।जीसी, एन = 174;बीएन <6 मिमी, एन = 153;बीएन 6-20 मिमी, एन = 91;एलए 6-20 मिमी, एन = 89;एलए 20-30 मिमी, एन = 77। ई रिसीवर ऑपरेटिंग विशेषता (आरओसी) वक्र नोड्यूल्स 6-20 मिमी के लिए विभेदक मॉडल प्रदर्शन दिखा रहा है।एफ संभाव्यता मूल्यों की गणना 6-20 मिमी मापने वाले नोड्यूल के लिए लॉजिस्टिक रिग्रेशन मॉडल के आधार पर की गई थी।ग्रे बिंदीदार रेखा इष्टतम कटऑफ मान (0.455) का प्रतिनिधित्व करती है।उपरोक्त संख्याएँ लॉस एंजिल्स के लिए अनुमानित मामलों का प्रतिशत दर्शाती हैं।दो-पूंछ वाले विद्यार्थी परीक्षण का उपयोग करें।पीसीए, प्रमुख घटक विश्लेषण।एयूसी, वक्र के अंतर्गत क्षेत्र।स्रोत डेटा स्रोत डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रदान किया जाता है।
समान फुफ्फुसीय नोड्यूल आकार (7-9 मिमी) के साथ चार नमूने (आयु 44-61 वर्ष) को प्रस्तावित घातक भविष्यवाणी मॉडल (छवि 4 ए, बी) के प्रदर्शन को चित्रित करने के लिए चुना गया था।प्रारंभिक स्क्रीनिंग पर, केस 1 को कैल्सीफिकेशन के साथ एक ठोस नोड्यूल के रूप में प्रस्तुत किया गया, जो कि सौम्यता से जुड़ी एक विशेषता है, जबकि केस 2 को बिना किसी स्पष्ट सौम्य विशेषताओं के एक अनिश्चित आंशिक रूप से ठोस नोड्यूल के रूप में प्रस्तुत किया गया है।अनुवर्ती सीटी स्कैन के तीन दौरों से पता चला कि ये मामले 4 साल की अवधि में स्थिर रहे और इसलिए उन्हें सौम्य नोड्यूल (छवि 4 ए) माना गया।सीरियल सीटी स्कैन के नैदानिक ​​​​मूल्यांकन की तुलना में, वर्तमान क्लासिफायरियर मॉडल के साथ एकल-शॉट सीरम मेटाबोलाइट विश्लेषण ने संभाव्य बाधाओं (तालिका 1) के आधार पर इन सौम्य नोड्यूल्स की जल्दी और सही ढंग से पहचान की।केस 3 में चित्र 4बी फुफ्फुस प्रत्यावर्तन के संकेतों के साथ एक नोड्यूल दिखाता है, जो अक्सर घातकता32 से जुड़ा होता है।केस 4 को एक अनिश्चित आंशिक रूप से ठोस नोड्यूल के रूप में प्रस्तुत किया गया है, जिसमें किसी सौम्य कारण का कोई सबूत नहीं है।इन सभी मामलों की भविष्यवाणी क्लासिफायर मॉडल (तालिका 1) के अनुसार घातक के रूप में की गई थी।फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा का आकलन फेफड़े के रिसेक्शन सर्जरी के बाद हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षण द्वारा प्रदर्शित किया गया था (चित्र 4बी)।बाहरी सत्यापन सेट के लिए, मेटाबॉलिक क्लासिफायर ने 6 मिमी (पूरक चित्रा 10) से बड़े अनिश्चित फेफड़े के नोड्यूल के दो मामलों की सटीक भविष्यवाणी की।
सौम्य नोड्यूल के दो मामलों के फेफड़ों की अक्षीय खिड़की की सीटी छवियां।मामले 1 में, 4 साल के बाद सीटी स्कैन में दाहिनी निचली लोब में कैल्सीफिकेशन के साथ 7 मिमी की एक स्थिर ठोस गांठ दिखाई दी।मामले 2 में, 5 साल के बाद सीटी स्कैन से दाहिने ऊपरी लोब में 7 मिमी व्यास के साथ एक स्थिर, आंशिक रूप से ठोस गांठ का पता चला।बी फेफड़ों की एक्सियल विंडो सीटी छवियां और फेफड़े के उच्छेदन से पहले चरण I एडेनोकार्सिनोमा के दो मामलों के संबंधित रोगविज्ञान अध्ययन।केस 3 में फुफ्फुस प्रत्यावर्तन के साथ दाहिने ऊपरी लोब में 8 मिमी व्यास वाली एक गांठ का पता चला।केस 4 में बाएं ऊपरी लोब में 9 मिमी मापने वाला आंशिक रूप से ठोस ग्राउंड-ग्लास नोड्यूल का पता चला।हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) फेफड़े के ऊतक के कटे हुए भाग का धुंधलापन (स्केल बार = 50 माइक्रोन) जो फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के एसिनर विकास पैटर्न को प्रदर्शित करता है।तीर सीटी छवियों पर पाए गए नोड्यूल को दर्शाते हैं।एच एंड ई छवियां रोगविज्ञानी द्वारा जांचे गए कई (>3) सूक्ष्म क्षेत्रों की प्रतिनिधि छवियां हैं।
कुल मिलाकर, हमारे परिणाम फुफ्फुसीय नोड्यूल के विभेदक निदान में सीरम मेटाबोलाइट बायोमार्कर के संभावित मूल्य को प्रदर्शित करते हैं, जो सीटी स्क्रीनिंग का मूल्यांकन करते समय चुनौतियां पैदा कर सकते हैं।
एक मान्य विभेदक मेटाबोलाइट पैनल के आधार पर, हमने प्रमुख चयापचय परिवर्तनों के जैविक सहसंबंधों की पहचान करने की कोशिश की।मेटाबोएनालिस्ट द्वारा केईजीजी पाथवे संवर्धन विश्लेषण ने दो दिए गए समूहों (एलए बनाम एचसी और एलए बनाम बीएन, समायोजित पी ≤ 0.001, प्रभाव> 0.01) के बीच 6 सामान्य महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित मार्गों की पहचान की।इन परिवर्तनों को पाइरूवेट चयापचय, ट्रिप्टोफैन चयापचय, नियासिन और निकोटिनमाइड चयापचय, ग्लाइकोलाइसिस, टीसीए चक्र और प्यूरीन चयापचय (छवि 5 ए) में गड़बड़ी की विशेषता थी।इसके बाद हमने पूर्ण परिमाणीकरण का उपयोग करके प्रमुख परिवर्तनों को सत्यापित करने के लिए लक्षित मेटाबोलॉमिक्स का प्रदर्शन किया।प्रामाणिक मेटाबोलाइट मानकों का उपयोग करके ट्रिपल क्वाड्रुपोल मास स्पेक्ट्रोमेट्री (क्यूक्यूक्यू) द्वारा सामान्य रूप से परिवर्तित मार्गों में सामान्य मेटाबोलाइट्स का निर्धारण।मेटाबोलॉमिक्स अध्ययन लक्ष्य नमूने की जनसांख्यिकीय विशेषताओं को पूरक तालिका 4 में शामिल किया गया है। हमारे वैश्विक मेटाबोलॉमिक्स परिणामों के अनुरूप, मात्रात्मक विश्लेषण ने पुष्टि की है कि बीएन और एचसी (छवि 5 बी, सी) की तुलना में एलए में हाइपोक्सैन्थिन और ज़ेन्थाइन, पाइरूवेट और लैक्टेट में वृद्धि हुई थी। पी <0.05).हालाँकि, बीएन और एचसी के बीच इन मेटाबोलाइट्स में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया।
बीएन और एचसी समूहों की तुलना में एलए समूह में महत्वपूर्ण रूप से भिन्न मेटाबोलाइट्स का केईजीजी मार्ग संवर्धन विश्लेषण।एक दो-पूंछ वाले ग्लोबलटेस्ट का उपयोग किया गया था, और पी मानों को होल्म-बोनफेरोनी विधि (समायोजित पी ≤ 0.001 और प्रभाव आकार> 0.01) का उपयोग करके समायोजित किया गया था।बी-डी वायलिन प्लॉट एलसी-एमएस/एमएस (एन = 70 प्रति समूह) द्वारा निर्धारित सीरम एचसी, बीएन और एलए में हाइपोक्सैन्थिन, ज़ैन्थिन, लैक्टेट, पाइरूवेट और ट्रिप्टोफैन स्तर दिखाते हैं।सफ़ेद और काली बिंदीदार रेखाएँ क्रमशः माध्यिका और चतुर्थक को दर्शाती हैं।ई वायलिन प्लॉट एलयूएडी-टीसीजीए डेटासेट में सामान्य फेफड़े के ऊतकों (एन = 59) की तुलना में फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा (एन = 513) में एसएलसी7ए5 और क्यूपीआरटी की सामान्यीकृत लॉग2टीपीएम (प्रति मिलियन प्रतिलेख) एमआरएनए अभिव्यक्ति दिखा रहा है।सफेद बॉक्स इंटरक्वेर्टाइल रेंज का प्रतिनिधित्व करता है, केंद्र में क्षैतिज काली रेखा मध्यिका का प्रतिनिधित्व करती है, और बॉक्स से फैली ऊर्ध्वाधर काली रेखा 95% आत्मविश्वास अंतराल (सीआई) का प्रतिनिधित्व करती है।एफ टीसीजीए डेटासेट में फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा (एन = 513) और सामान्य फेफड़े के ऊतक (एन = 59) में एसएलसी7ए5 और जीएपीडीएच अभिव्यक्ति का पियर्सन सहसंबंध प्लॉट।ग्रे क्षेत्र 95% सीआई का प्रतिनिधित्व करता है।आर, पियर्सन सहसंबंध गुणांक।जी A549 कोशिकाओं में सामान्यीकृत सेलुलर ट्रिप्टोफैन स्तर, LC-MS/MS द्वारा निर्धारित गैर-विशिष्ट shRNA नियंत्रण (NC) और shSLC7A5 (Sh1, Sh2) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया।प्रत्येक समूह में पांच जैविक रूप से स्वतंत्र नमूनों का सांख्यिकीय विश्लेषण प्रस्तुत किया गया है।h A549 कोशिकाओं (NC) और SLC7A5 नॉकडाउन A549 कोशिकाओं (Sh1, Sh2) में NADt (NAD+ और NADH सहित कुल NAD) का सेलुलर स्तर।प्रत्येक समूह में तीन जैविक रूप से स्वतंत्र नमूनों का सांख्यिकीय विश्लेषण प्रस्तुत किया गया है।i SLC7A5 नॉकडाउन से पहले और बाद में A549 कोशिकाओं की ग्लाइकोलाइटिक गतिविधि को बाह्यकोशिकीय अम्लीकरण दर (ECAR) (n = प्रति समूह 4 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने) द्वारा मापा गया था।2-डीजी, 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज।दो-पूंछ वाले छात्र के टी परीक्षण का उपयोग (बी-एच) में किया गया था।(जी-आई) में, त्रुटि पट्टियाँ माध्य ± एसडी का प्रतिनिधित्व करती हैं, प्रत्येक प्रयोग तीन बार स्वतंत्र रूप से किया गया था और परिणाम समान थे।स्रोत डेटा स्रोत डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रदान किया जाता है।
एलए समूह में परिवर्तित ट्रिप्टोफैन चयापचय के महत्वपूर्ण प्रभाव को ध्यान में रखते हुए, हमने क्यूक्यूक्यू का उपयोग करके एचसी, बीएन और एलए समूहों में सीरम ट्रिप्टोफैन स्तर का भी आकलन किया।हमने पाया कि एचसी या बीएन (पी <0.001, चित्र 5डी) की तुलना में एलए में सीरम ट्रिप्टोफैन कम हो गया था, जो पिछले निष्कर्षों के अनुरूप है कि नियंत्रण समूह से स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में फेफड़ों के कैंसर के रोगियों में ट्रिप्टोफैन का स्तर कम है। ,35.पीईटी/सीटी ट्रैसर 11सी-मिथाइल-एल-ट्रिप्टोफैन का उपयोग करते हुए एक अन्य अध्ययन में पाया गया कि फेफड़ों के कैंसर के ऊतकों में ट्रिप्टोफैन सिग्नल प्रतिधारण समय सौम्य घावों या सामान्य ऊतक36 की तुलना में काफी बढ़ गया था।हम अनुमान लगाते हैं कि एलए सीरम में ट्रिप्टोफैन में कमी फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं द्वारा सक्रिय ट्रिप्टोफैन ग्रहण को प्रतिबिंबित कर सकती है।
यह भी ज्ञात है कि ट्रिप्टोफैन अपचय के कियूरेनिन मार्ग का अंतिम उत्पाद NAD+37,38 है, जो ग्लाइकोलाइसिस39 में 1,3-बिस्फोस्फोग्लिसरेट के साथ ग्लिसराल्डिहाइड-3-फॉस्फेट की प्रतिक्रिया के लिए एक महत्वपूर्ण सब्सट्रेट है।जबकि पिछले अध्ययनों ने प्रतिरक्षा विनियमन में ट्रिप्टोफैन अपचय की भूमिका पर ध्यान केंद्रित किया है, हमने वर्तमान अध्ययन में देखे गए ट्रिप्टोफैन डिसरेग्यूलेशन और ग्लाइकोलाइटिक मार्गों के बीच परस्पर क्रिया को स्पष्ट करने की कोशिश की है।सॉल्यूट ट्रांसपोर्टर परिवार 7 सदस्य 5 (एसएलसी7ए5) को ट्रिप्टोफैन ट्रांसपोर्टर43,44,45 के रूप में जाना जाता है।क्विनोलिनिक एसिड फॉस्फोरिबोसिलट्रांसफेरेज़ (क्यूपीआरटी) एक एंजाइम है जो किन्यूरेनिन मार्ग के नीचे स्थित होता है जो क्विनोलिनिक एसिड को एनएएमएन46 में परिवर्तित करता है।LUAD TCGA डेटासेट के निरीक्षण से पता चला कि SLC7A5 और QPRT दोनों को सामान्य ऊतक (चित्र 5e) की तुलना में ट्यूमर ऊतक में काफी हद तक अपग्रेड किया गया था।यह वृद्धि चरण I और II के साथ-साथ फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा (पूरक चित्र 11) के चरण III और IV में देखी गई, जो ट्यूमरजेनिसिस से जुड़े ट्रिप्टोफैन चयापचय में प्रारंभिक गड़बड़ी का संकेत देती है।
इसके अतिरिक्त, LUAD-TCGA डेटासेट ने कैंसर रोगी के नमूनों में SLC7A5 और GAPDH mRNA अभिव्यक्ति के बीच एक सकारात्मक सहसंबंध दिखाया (r = 0.45, p = 1.55E-26, चित्र 5f)।इसके विपरीत, सामान्य फेफड़े के ऊतकों में ऐसे जीन हस्ताक्षरों के बीच कोई महत्वपूर्ण सहसंबंध नहीं पाया गया (आर = 0.25, पी = 0.06, चित्र 5एफ)।A549 कोशिकाओं में SLC7A5 (अनुपूरक चित्र 12) के नष्ट होने से सेलुलर ट्रिप्टोफैन और NAD (H) का स्तर काफी कम हो गया (चित्र 5g,h), जिसके परिणामस्वरूप बाह्यकोशिकीय अम्लीकरण दर (ECAR) (चित्र 1) द्वारा मापी गई ग्लाइकोलाइटिक गतिविधि क्षीण हो गई।5i).इस प्रकार, सीरम में चयापचय परिवर्तन और इन विट्रो पहचान के आधार पर, हम अनुमान लगाते हैं कि ट्रिप्टोफैन चयापचय कियूरेनिन मार्ग के माध्यम से एनएडी+ उत्पन्न कर सकता है और फेफड़ों के कैंसर में ग्लाइकोलाइसिस को बढ़ावा देने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है।
अध्ययनों से पता चला है कि एलडीसीटी द्वारा बड़ी संख्या में अनिश्चित फुफ्फुसीय नोड्यूल का पता लगाने से घातकता के गलत-सकारात्मक निदान के कारण अतिरिक्त परीक्षण जैसे पीईटी-सीटी, फेफड़े की बायोप्सी और अति उपचार की आवश्यकता हो सकती है।31 जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है, हमारे अध्ययन ने संभावित नैदानिक ​​​​मूल्य वाले सीरम मेटाबोलाइट्स के एक पैनल की पहचान की जो जोखिम स्तरीकरण और सीटी द्वारा पता लगाए गए फुफ्फुसीय नोड्यूल के बाद के प्रबंधन में सुधार कर सकता है।
सौम्य या घातक कारणों का संकेत देने वाली इमेजिंग विशेषताओं के साथ कम खुराक वाली कंप्यूटेड टोमोग्राफी (एलडीसीटी) का उपयोग करके पल्मोनरी नोड्यूल का मूल्यांकन किया जाता है।नोड्यूल्स के अनिश्चित परिणाम के कारण बार-बार अनुवर्ती दौरे, अनावश्यक हस्तक्षेप और अत्यधिक उपचार हो सकता है।नैदानिक ​​​​मूल्य के साथ सीरम चयापचय वर्गीकरणकर्ताओं को शामिल करने से जोखिम मूल्यांकन और फुफ्फुसीय नोड्यूल के बाद के प्रबंधन में सुधार हो सकता है।पीईटी पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी।
यूएस एनएलएसटी अध्ययन और यूरोपीय नेल्सन अध्ययन के आंकड़ों से पता चलता है कि कम खुराक वाली कंप्यूटेड टोमोग्राफी (एलडीसीटी) के साथ उच्च जोखिम वाले समूहों की जांच करने से फेफड़ों के कैंसर की मृत्यु दर कम हो सकती है।हालांकि, एलडीसीटी द्वारा पता लगाए गए बड़ी संख्या में आकस्मिक फुफ्फुसीय नोड्यूल के जोखिम मूल्यांकन और उसके बाद के नैदानिक ​​​​प्रबंधन सबसे चुनौतीपूर्ण बने हुए हैं।मुख्य लक्ष्य विश्वसनीय बायोमार्कर को शामिल करके मौजूदा एलडीसीटी-आधारित प्रोटोकॉल के सही वर्गीकरण को अनुकूलित करना है।
स्वस्थ नियंत्रण वाले फेफड़ों के कैंसर की तुलना करके कुछ आणविक बायोमार्कर, जैसे रक्त मेटाबोलाइट्स की पहचान की गई है।15,17।वर्तमान अध्ययन में, हमने एलडीसीटी द्वारा संयोगवश पता लगाए गए सौम्य और घातक फुफ्फुसीय नोड्यूल के बीच अंतर करने के लिए सीरम मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण के अनुप्रयोग पर ध्यान केंद्रित किया।हमने यूपीएलसी-एचआरएमएस विश्लेषण का उपयोग करके स्वस्थ नियंत्रण (एचसी), सौम्य फेफड़े के नोड्यूल (बीएन), और चरण I फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा (एलए) नमूनों के वैश्विक सीरम चयापचय की तुलना की।हमने पाया कि एचसी और बीएन में समान चयापचय प्रोफ़ाइल थी, जबकि एलए ने एचसी और बीएन की तुलना में महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाए।हमने सीरम मेटाबोलाइट्स के दो सेटों की पहचान की जो एलए को एचसी और बीएन से अलग करते हैं।
सौम्य और घातक नोड्यूल्स के लिए वर्तमान एलडीसीटी-आधारित पहचान योजना मुख्य रूप से समय के साथ नोड्यूल्स के आकार, घनत्व, आकारिकी और विकास दर पर आधारित है।पिछले अध्ययनों से पता चला है कि गांठों के आकार का फेफड़ों के कैंसर की संभावना से गहरा संबंध है।यहां तक ​​कि उच्च जोखिम वाले रोगियों में भी, नोड्स <6 मिमी में घातकता का जोखिम <1% है।6 से 20 मिमी मापने वाले नोड्यूल्स के लिए घातक होने का जोखिम 8% से 64%30 तक होता है।इसलिए, फ़्लेश्नर सोसाइटी नियमित सीटी फॉलो-अप के लिए 6 मिमी के कटऑफ व्यास की सिफारिश करती है।29 हालाँकि, 6 मिमी से बड़े अनिश्चित फुफ्फुसीय नोड्यूल (आईपीएन) का जोखिम मूल्यांकन और प्रबंधन पर्याप्त रूप से नहीं किया गया है 31।जन्मजात हृदय रोग का वर्तमान प्रबंधन आम तौर पर लगातार सीटी निगरानी के साथ सतर्क प्रतीक्षा पर आधारित होता है।
मान्य मेटाबोलोम के आधार पर, हमने पहली बार स्वस्थ व्यक्तियों और सौम्य नोड्यूल्स <6 मिमी के बीच मेटाबॉलिक हस्ताक्षर के ओवरलैप का प्रदर्शन किया।जैविक समानता पिछले सीटी निष्कर्षों के अनुरूप है कि नोड्यूल्स <6 मिमी के लिए घातक होने का जोखिम बिना नोड्स वाले विषयों के लिए उतना ही कम है।30 यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हमारे परिणाम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि सौम्य नोड्यूल्स <6 मिमी और ≥6 मिमी में उच्च है मेटाबॉलिक प्रोफाइल में समानता, यह सुझाव देती है कि सौम्य एटियोलॉजी की कार्यात्मक परिभाषा नोड्यूल आकार की परवाह किए बिना सुसंगत है।इस प्रकार, आधुनिक डायग्नोस्टिक सीरम मेटाबोलाइट पैनल एक नियम-आउट परीक्षण के रूप में एक एकल परख प्रदान कर सकते हैं जब नोड्यूल शुरू में सीटी पर पाए जाते हैं और संभावित रूप से सीरियल मॉनिटरिंग को कम करते हैं।उसी समय, चयापचय बायोमार्कर के एक ही पैनल ने सौम्य नोड्यूल से ≥6 मिमी आकार के घातक नोड्यूल को अलग किया और सीटी छवियों पर समान आकार और अस्पष्ट रूपात्मक विशेषताओं के आईपीएन के लिए सटीक भविष्यवाणियां प्रदान कीं।इस सीरम मेटाबोलिज्म क्लासिफायर ने 0.927 के एयूसी के साथ नोड्यूल्स ≥6 मिमी की घातकता की भविष्यवाणी करने में अच्छा प्रदर्शन किया।एक साथ लेने पर, हमारे परिणाम दर्शाते हैं कि अद्वितीय सीरम मेटाबॉलिक हस्ताक्षर विशेष रूप से प्रारंभिक ट्यूमर-प्रेरित चयापचय परिवर्तनों को प्रतिबिंबित कर सकते हैं और नोड्यूल आकार से स्वतंत्र, जोखिम भविष्यवक्ताओं के रूप में संभावित मूल्य हो सकते हैं।
विशेष रूप से, फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा (एलयूएडी) और स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एलयूएससी) गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी) के मुख्य प्रकार हैं।यह देखते हुए कि एलयूएससी तम्बाकू के उपयोग47 से दृढ़ता से जुड़ा हुआ है और एलयूएडी सीटी स्क्रीनिंग48 पर पाए जाने वाले आकस्मिक फेफड़ों के नोड्यूल का सबसे आम ऊतक विज्ञान है, हमारा क्लासिफायरियर मॉडल विशेष रूप से चरण I एडेनोकार्सिनोमा नमूनों के लिए बनाया गया था।वांग और सहकर्मियों ने एलयूएडी पर भी ध्यान केंद्रित किया और स्वस्थ व्यक्तियों से प्रारंभिक चरण के फेफड़ों के कैंसर को अलग करने के लिए लिपिडोमिक्स का उपयोग करके नौ लिपिड हस्ताक्षरों की पहचान की।हमने चरण I एलयूएससी और 74 सौम्य नोड्यूल के 16 मामलों पर वर्तमान क्लासिफायर मॉडल का परीक्षण किया और कम एलयूएससी भविष्यवाणी सटीकता (एयूसी 0.776) देखी, जिससे पता चलता है कि एलयूएडी और एलयूएससी के अपने स्वयं के मेटाबॉलिक हस्ताक्षर हो सकते हैं।वास्तव में, LUAD और LUSC को एटियलजि, जैविक उत्पत्ति और आनुवंशिक विपथन49 में भिन्न दिखाया गया है।इसलिए, स्क्रीनिंग कार्यक्रमों में जनसंख्या-आधारित फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने के लिए प्रशिक्षण मॉडल में अन्य प्रकार के ऊतक विज्ञान को शामिल किया जाना चाहिए।
यहां, हमने स्वस्थ नियंत्रण और सौम्य नोड्यूल की तुलना में फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा में छह सबसे अधिक बार परिवर्तित मार्गों की पहचान की।ज़ेन्थाइन और हाइपोक्सैन्थिन प्यूरीन चयापचय पथ के सामान्य मेटाबोलाइट्स हैं।हमारे परिणामों के अनुरूप, फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा वाले रोगियों के सीरम या ऊतकों में स्वस्थ नियंत्रण वाले या प्रीइनवेसिव चरण 15,50 के रोगियों की तुलना में प्यूरीन चयापचय से जुड़े मध्यवर्ती में काफी वृद्धि हुई थी।ऊंचा सीरम ज़ेन्थाइन और हाइपोक्सैन्थिन स्तर तेजी से फैलने वाली कैंसर कोशिकाओं के लिए आवश्यक उपचय को दर्शा सकता है।ग्लूकोज चयापचय का अनियमित होना कैंसर चयापचय51 की एक प्रसिद्ध पहचान है।यहां, हमने एचसी और बीएन समूह की तुलना में एलए समूह में पाइरूवेट और लैक्टेट में उल्लेखनीय वृद्धि देखी, जो गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी) रोगियों के सीरम चयापचय प्रोफाइल में ग्लाइकोलाइटिक मार्ग असामान्यताओं की पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है और स्वस्थ नियंत्रण.परिणाम सुसंगत52,53 हैं।
महत्वपूर्ण रूप से, हमने फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के सीरम में पाइरूवेट और ट्रिप्टोफैन चयापचय के बीच एक विपरीत संबंध देखा।एचसी या बीएन समूह की तुलना में एलए समूह में सीरम ट्रिप्टोफैन का स्तर कम हो गया था।दिलचस्प बात यह है कि एक संभावित समूह का उपयोग करते हुए पिछले बड़े पैमाने के अध्ययन में पाया गया कि परिसंचारी ट्रिप्टोफैन का निम्न स्तर फेफड़ों के कैंसर 54 के बढ़ते जोखिम से जुड़ा था।ट्रिप्टोफैन एक आवश्यक अमीनो एसिड है जो हमें पूरी तरह से भोजन से मिलता है।हम यह निष्कर्ष निकालते हैं कि फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा में सीरम ट्रिप्टोफैन की कमी इस मेटाबोलाइट की तेजी से कमी को दर्शा सकती है।यह सर्वविदित है कि कियूरेनिन मार्ग के माध्यम से ट्रिप्टोफैन अपचय का अंतिम उत्पाद डे नोवो एनएडी+ संश्लेषण का स्रोत है।क्योंकि NAD+ का उत्पादन मुख्य रूप से बचाव मार्ग के माध्यम से होता है, स्वास्थ्य और बीमारी में ट्रिप्टोफैन चयापचय में NAD+ का महत्व निर्धारित किया जाना बाकी है।टीसीजीए डेटाबेस के हमारे विश्लेषण से पता चला है कि ट्रिप्टोफैन ट्रांसपोर्टर सॉल्यूट ट्रांसपोर्टर 7ए5 (एसएलसी7ए5) की अभिव्यक्ति सामान्य नियंत्रण की तुलना में फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा में काफी बढ़ गई थी और ग्लाइकोलाइटिक एंजाइम जीएपीडीएच की अभिव्यक्ति के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध थी।पिछले अध्ययनों ने मुख्य रूप से एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को दबाने में ट्रिप्टोफैन अपचय की भूमिका पर ध्यान केंद्रित किया है।यहां हम प्रदर्शित करते हैं कि फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं में एसएलसी7ए5 की कमी से ट्रिप्टोफैन के अवशोषण में अवरोध के परिणामस्वरूप सेलुलर एनएडी स्तर में कमी आती है और ग्लाइकोलाइटिक गतिविधि का सहवर्ती क्षीणन होता है।संक्षेप में, हमारा अध्ययन फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के घातक परिवर्तन से जुड़े सीरम चयापचय में परिवर्तन के लिए एक जैविक आधार प्रदान करता है।
एनएससीएलसी वाले रोगियों में ईजीएफआर उत्परिवर्तन सबसे आम चालक उत्परिवर्तन हैं।हमारे अध्ययन में, हमने पाया कि ईजीएफआर उत्परिवर्तन (एन = 41) वाले रोगियों में जंगली-प्रकार के ईजीएफआर (एन = 31) वाले रोगियों के समान समग्र मेटाबोलॉमिक प्रोफाइल थे, हालांकि हमने एसाइलकार्निटाइन रोगियों में कुछ ईजीएफआर उत्परिवर्ती रोगियों के सीरम स्तर में कमी पाई।एसाइलकार्निटाइन का स्थापित कार्य एसाइल समूहों को साइटोप्लाज्म से माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में ले जाना है, जिससे ऊर्जा उत्पन्न करने के लिए फैटी एसिड का ऑक्सीकरण होता है 55।हमारे निष्कर्षों के अनुरूप, एक हालिया अध्ययन ने 102 फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा ऊतक नमूनों50 के वैश्विक चयापचय का विश्लेषण करके ईजीएफआर उत्परिवर्ती और ईजीएफआर जंगली-प्रकार के ट्यूमर के बीच समान चयापचय प्रोफाइल की पहचान की।दिलचस्प बात यह है कि एसाइलकार्निटाइन सामग्री ईजीएफआर उत्परिवर्ती समूह में भी पाई गई थी।इसलिए, क्या एसाइक्लेर्निटाइन के स्तर में परिवर्तन ईजीएफआर-प्रेरित चयापचय परिवर्तनों को दर्शाता है और अंतर्निहित आणविक मार्ग आगे के अध्ययन के योग्य हो सकते हैं।
निष्कर्ष में, हमारा अध्ययन फुफ्फुसीय नोड्यूल के विभेदक निदान के लिए एक सीरम चयापचय वर्गीकरण स्थापित करता है और एक वर्कफ़्लो का प्रस्ताव करता है जो जोखिम मूल्यांकन को अनुकूलित कर सकता है और सीटी स्कैन स्क्रीनिंग के आधार पर नैदानिक ​​​​प्रबंधन की सुविधा प्रदान कर सकता है।
इस अध्ययन को सन यात-सेन विश्वविद्यालय कैंसर अस्पताल की आचार समिति, सन यात-सेन विश्वविद्यालय के पहले संबद्ध अस्पताल और झेंग्झौ विश्वविद्यालय कैंसर अस्पताल की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।खोज और आंतरिक सत्यापन समूहों में, स्वस्थ व्यक्तियों से 174 सीरा और सौम्य नोड्यूल्स से 244 सीरा, कैंसर नियंत्रण और रोकथाम विभाग, सन यात-सेन यूनिवर्सिटी कैंसर सेंटर में वार्षिक चिकित्सा परीक्षाओं से गुजरने वाले व्यक्तियों और 166 सौम्य नोड्यूल्स से एकत्र किए गए थे।सीरम.स्टेज I फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा को सन यात-सेन यूनिवर्सिटी कैंसर सेंटर से एकत्र किया गया था।बाहरी सत्यापन समूह में, सौम्य नोड्यूल्स के 48 मामले, सन यात-सेन विश्वविद्यालय के पहले संबद्ध अस्पताल से चरण I फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के 39 मामले और झेंग्झौ कैंसर अस्पताल से चरण I फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के 24 मामले थे।सन यात-सेन यूनिवर्सिटी कैंसर सेंटर ने स्थापित मेटाबॉलिक क्लासिफायरियर की नैदानिक ​​क्षमता का परीक्षण करने के लिए चरण I स्क्वैमस सेल फेफड़ों के कैंसर के 16 मामले भी एकत्र किए (रोगी की विशेषताओं को पूरक तालिका 5 में दिखाया गया है)।डिस्कवरी समूह और आंतरिक सत्यापन समूह से नमूने जनवरी 2018 और मई 2020 के बीच एकत्र किए गए थे। बाहरी सत्यापन समूह के नमूने अगस्त 2021 और अक्टूबर 2022 के बीच एकत्र किए गए थे। लिंग पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, प्रत्येक को लगभग समान संख्या में पुरुष और महिला मामले सौंपे गए थे। जत्था।डिस्कवरी टीम और आंतरिक समीक्षा टीम।प्रतिभागी का लिंग स्व-रिपोर्ट के आधार पर निर्धारित किया गया था।सभी प्रतिभागियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी और कोई मुआवजा प्रदान नहीं किया गया था।सौम्य नोड्यूल वाले विषय विश्लेषण के समय 2 से 5 वर्षों में स्थिर सीटी स्कैन स्कोर वाले थे, बाहरी सत्यापन नमूने से 1 मामले को छोड़कर, जिसे प्रीऑपरेटिव रूप से एकत्र किया गया था और हिस्टोपैथोलॉजी द्वारा निदान किया गया था।क्रोनिक ब्रोंकाइटिस के अपवाद के साथ.फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के मामलों को फेफड़े के उच्छेदन से पहले एकत्र किया गया था और रोग निदान द्वारा पुष्टि की गई थी।उपवास रक्त के नमूने बिना किसी एंटीकोआगुलंट्स के सीरम पृथक्करण ट्यूबों में एकत्र किए गए थे।रक्त के नमूनों को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए जमाया गया और फिर सीरम सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने के लिए 2851 × जी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया।मेटाबोलाइट निष्कर्षण तक सीरम एलिकोट्स -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए थे।सन यात-सेन यूनिवर्सिटी कैंसर सेंटर के कैंसर रोकथाम और चिकित्सा परीक्षण विभाग ने 100 स्वस्थ दाताओं से सीरम का एक पूल एकत्र किया, जिसमें 40 से 55 वर्ष की आयु के पुरुषों और महिलाओं की समान संख्या शामिल थी।प्रत्येक दाता नमूने की समान मात्रा मिश्रित की गई, परिणामी पूल को अलग किया गया और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया।सीरम मिश्रण का उपयोग गुणवत्ता नियंत्रण और डेटा मानकीकरण के लिए संदर्भ सामग्री के रूप में किया गया था।
संदर्भ सीरम और परीक्षण नमूनों को पिघलाया गया और मेटाबोलाइट्स को एक संयुक्त निष्कर्षण विधि (एमटीबीई / मेथनॉल / पानी) 56 का उपयोग करके निकाला गया।संक्षेप में, 50 μl सीरम को 225 μl बर्फ-ठंडा मेथनॉल और 750 μl बर्फ-ठंडा मिथाइल टर्ट-ब्यूटाइल ईथर (MTBE) के साथ मिलाया गया था।मिश्रण को हिलाएं और 1 घंटे के लिए बर्फ पर रखें।फिर नमूनों को मिश्रित किया गया और आंतरिक मानकों (13C-लैक्टेट, 13C3-पाइरूवेट, 13C-मेथिओनिन, और 13C6-आइसोल्यूसीन, कैम्ब्रिज आइसोटोप प्रयोगशालाओं से खरीदा गया) वाले 188 μl एमएस-ग्रेड पानी के साथ भंवर मिलाया गया।फिर मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 15,000 × जी पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, और निचले चरण को सकारात्मक और नकारात्मक मोड में एलसी-एमएस विश्लेषण के लिए दो ट्यूबों (125 μL प्रत्येक) में स्थानांतरित किया गया।अंत में, नमूने को उच्च गति वाले वैक्यूम कंसंट्रेटर में सूखने के लिए वाष्पित कर दिया गया।
सूखे मेटाबोलाइट्स को 80% एसीटोनिट्राइल के 120 μl में पुनर्गठित किया गया, 5 मिनट के लिए भंवर में डाला गया, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 15,000 × जी पर सेंट्रीफ्यूज किया गया।चयापचय अध्ययन के लिए सतह पर तैरनेवाला को सूक्ष्म आवेषण के साथ एम्बर कांच की शीशियों में स्थानांतरित किया गया था।अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-हाई-रेजोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (यूपीएलसी-एचआरएमएस) प्लेटफॉर्म पर अलक्षित मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण।मेटाबोलाइट्स को डायोनेक्स अल्टिमेट 3000 यूपीएलसी सिस्टम और एक एक्विटी बीईएच एमाइड कॉलम (2.1 × 100 मिमी, 1.7 माइक्रोन, वाटर्स) का उपयोग करके अलग किया गया था।सकारात्मक आयन मोड में, मोबाइल चरण 95% (ए) और 50% एसीटोनिट्राइल (बी) थे, प्रत्येक में 10 मिमीोल/एल अमोनियम एसीटेट और 0.1% फॉर्मिक एसिड होता था।नकारात्मक मोड में, मोबाइल चरण ए और बी में क्रमशः 95% और 50% एसीटोनिट्राइल होता है, दोनों चरणों में 10 मिमीओल/एल अमोनियम एसीटेट, पीएच = 9 होता है। ग्रेडिएंट प्रोग्राम इस प्रकार था: 0-0.5 मिनट, 2% बी;0.5-12 मिनट, 2-50% बी;12-14 मिनट, 50-98% बी;14-16 मिनट, 98% बी;16-16.1.न्यूनतम, 98-2% बी;16.1-20 मिनट, 2% बी। ऑटोसैंपलर में कॉलम को 40 डिग्री सेल्सियस पर और नमूने को 10 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था।प्रवाह दर 0.3 मिली/मिनट थी, इंजेक्शन की मात्रा 3 μl थी।इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) स्रोत के साथ एक क्यू-एक्सएक्टिव ऑर्बिट्रैप मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) को पूर्ण स्कैन मोड में संचालित किया गया था और बड़ी मात्रा में डेटा एकत्र करने के लिए डीडीएमएस2 मॉनिटरिंग मोड के साथ जोड़ा गया था।एमएस पैरामीटर इस प्रकार सेट किए गए थे: स्प्रे वोल्टेज +3.8 केवी/- 3.2 केवी, केशिका तापमान 320 डिग्री सेल्सियस, परिरक्षण गैस 40 एआरबी, सहायक गैस 10 एआरबी, जांच हीटर तापमान 350 डिग्री सेल्सियस, स्कैनिंग रेंज 70-1050 मीटर/घंटा, संकल्प।70 000. डेटा Xcalibur 4.1 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके हासिल किया गया था।
डेटा गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, प्रत्येक नमूने से सतह पर तैरनेवाला के 10 μL एलिकोट्स को हटाकर पूल किए गए गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) नमूने तैयार किए गए थे।यूपीएलसी-एमएस प्रणाली की स्थिरता का आकलन करने के लिए विश्लेषणात्मक अनुक्रम की शुरुआत में छह गुणवत्ता नियंत्रण नमूना इंजेक्शनों का विश्लेषण किया गया।गुणवत्ता नियंत्रण नमूने समय-समय पर बैच में पेश किए जाते हैं।इस अध्ययन में सीरम नमूनों के सभी 11 बैचों का विश्लेषण एलसी-एमएस द्वारा किया गया था।निष्कर्षण प्रक्रिया की निगरानी करने और बैच-टू-बैच प्रभावों को समायोजित करने के लिए 100 स्वस्थ दाताओं से सीरम पूल मिश्रण के अंशों को संबंधित बैचों में संदर्भ सामग्री के रूप में उपयोग किया गया था।डिस्कवरी कॉहोर्ट, आंतरिक सत्यापन कॉहोर्ट और बाहरी सत्यापन कॉहोर्ट का अलक्षित मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण सन यात-सेन विश्वविद्यालय के मेटाबोलॉमिक्स सेंटर में किया गया था।ग्वांगडोंग यूनिवर्सिटी ऑफ़ टेक्नोलॉजी एनालिसिस एंड टेस्टिंग सेंटर की बाहरी प्रयोगशाला ने क्लासिफायर मॉडल के प्रदर्शन का परीक्षण करने के लिए बाहरी समूह से 40 नमूनों का भी विश्लेषण किया।
निष्कर्षण और पुनर्गठन के बाद, मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग (एमआरएम) मोड में इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) स्रोत के साथ अल्ट्रा-उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एगिलेंट 6495 ट्रिपल क्वाड्रुपोल) का उपयोग करके सीरम मेटाबोलाइट्स की पूर्ण मात्रा को मापा गया था।मेटाबोलाइट्स को अलग करने के लिए एक ACQUITY BEH एमाइड कॉलम (2.1 × 100 मिमी, 1.7 माइक्रोन, वाटर्स) का उपयोग किया गया था।मोबाइल चरण में 90% (ए) और 5% एसीटोनिट्राइल (बी) के साथ 10 मिमीओल/एल अमोनियम एसीटेट और 0.1% अमोनिया समाधान शामिल थे।ग्रेडिएंट प्रोग्राम इस प्रकार था: 0-1.5 मिनट, 0% बी;1.5-6.5 मिनट, 0-15% बी;6.5-8 मिनट, 15% बी;8-8.5 मिनट, 15%-0% बी;8.5-11.5 मिनट, 0%बी।ऑटोसैंपलर में कॉलम को 40 डिग्री सेल्सियस पर और सैंपल को 10 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था।प्रवाह दर 0.3 एमएल/मिनट थी और इंजेक्शन की मात्रा 1 μL थी।एमएस पैरामीटर निम्नानुसार सेट किए गए थे: केशिका वोल्टेज ±3.5 केवी, नेब्युलाइज़र दबाव 35 पीएसआई, शीथ गैस प्रवाह 12 एल/मिनट, शीथ गैस तापमान 350 डिग्री सेल्सियस, सुखाने वाली गैस तापमान 250 डिग्री सेल्सियस, और सुखाने वाली गैस प्रवाह 14 एल/मिनट।ट्रिप्टोफैन, पाइरूवेट, लैक्टेट, हाइपोक्सैन्थिन और ज़ेन्थाइन के एमआरएम रूपांतरण 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 और 151.0–107 थे।क्रमशः 9.मास हंटर बी.07.00 (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज) का उपयोग करके डेटा एकत्र किया गया था।सीरम नमूनों के लिए, ट्रिप्टोफैन, पाइरूवेट, लैक्टेट, हाइपोक्सैन्थिन और ज़ेन्थाइन को मानक मिश्रण समाधानों के अंशांकन वक्रों का उपयोग करके मात्राबद्ध किया गया था।कोशिका नमूनों के लिए, ट्रिप्टोफैन सामग्री को आंतरिक मानक और कोशिका प्रोटीन द्रव्यमान के अनुसार सामान्यीकृत किया गया था।
कंपाउंड डिस्कवरी 3.1 और ट्रेसफाइंडर 4.0 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके पीक निष्कर्षण (एम/जेड और रिटेंशन टाइम (आरटी)) किया गया था।बैचों के बीच संभावित अंतर को खत्म करने के लिए, सापेक्ष बहुतायत प्राप्त करने के लिए परीक्षण नमूने के प्रत्येक विशेषता शिखर को उसी बैच से संदर्भ सामग्री के विशेषता शिखर से विभाजित किया गया था।मानकीकरण से पहले और बाद में आंतरिक मानकों के सापेक्ष मानक विचलन पूरक तालिका 6 में दिखाए गए हैं। दोनों समूहों के बीच अंतर झूठी खोज दर (एफडीआर <0.05, विलकॉक्सन हस्ताक्षरित रैंक परीक्षण) और गुना परिवर्तन (> 1.2 या <0.83) द्वारा विशेषता थे।निकाली गई विशेषताओं का कच्चा एमएस डेटा और संदर्भ सीरम-संशोधित एमएस डेटा क्रमशः पूरक डेटा 1 और पूरक डेटा 2 में दिखाया गया है।पीक एनोटेशन पहचान के चार परिभाषित स्तरों के आधार पर किया गया था, जिसमें पहचाने गए मेटाबोलाइट्स, अनुमानित रूप से एनोटेट किए गए यौगिक, अनुमानित रूप से विशेषता वाले यौगिक वर्ग और अज्ञात यौगिक 22 शामिल थे।कंपाउंड डिस्कवरी 3.1 (एमजेडक्लाउड, एचएमडीबी, केमस्पाइडर) में डेटाबेस खोजों के आधार पर, एमजेडक्लाउड (स्कोर> 85) या केमस्पाइडर में मान्य मानकों या सटीक मिलान एनोटेशन से मेल खाने वाले एमएस/एमएस वाले जैविक यौगिकों को अंततः अंतर चयापचय के बीच मध्यवर्ती के रूप में चुना गया था।प्रत्येक सुविधा के लिए पीक एनोटेशन पूरक डेटा 3 में शामिल हैं। मेटाबोएनालिस्ट 5.0 का उपयोग योग-सामान्यीकृत मेटाबोलाइट प्रचुरता के एकतरफा विश्लेषण के लिए किया गया था।मेटाबोएनालिस्ट 5.0 ने महत्वपूर्ण रूप से भिन्न मेटाबोलाइट्स के आधार पर केईजीजी मार्ग संवर्धन विश्लेषण का भी मूल्यांकन किया।प्रिंसिपल कंपोनेंट विश्लेषण (पीसीए) और आंशिक न्यूनतम वर्ग विभेदक विश्लेषण (पीएलएस-डीए) का विश्लेषण स्टैक सामान्यीकरण और ऑटोस्केलिंग के साथ रोपल्स सॉफ्टवेयर पैकेज (v.1.26.4) का उपयोग करके किया गया था।नोड्यूल घातकता की भविष्यवाणी के लिए इष्टतम मेटाबोलाइट बायोमार्कर मॉडल कम से कम पूर्ण संकोचन और चयन ऑपरेटर (LASSO, R पैकेज v.4.1-3) के साथ बाइनरी लॉजिस्टिक रिग्रेशन का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था।पहचान और सत्यापन सेट में विभेदक मॉडल के प्रदर्शन को पीआरओसी पैकेज (v.1.18.0.) के अनुसार आरओसी विश्लेषण के आधार पर एयूसी का अनुमान लगाकर चित्रित किया गया था।मॉडल के अधिकतम यूडेन सूचकांक (संवेदनशीलता + विशिष्टता - 1) के आधार पर इष्टतम संभाव्यता कटऑफ प्राप्त किया गया था।सीमा से कम या अधिक मान वाले नमूनों की भविष्यवाणी क्रमशः सौम्य नोड्यूल और फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के रूप में की जाएगी।
A549 कोशिकाएं (#CCL-185, अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन) 10% FBS युक्त F-12K माध्यम में विकसित की गईं।SLC7A5 और एक गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण (NC) को लक्षित करने वाले लघु हेयरपिन आरएनए (shRNA) अनुक्रमों को लेंटिवायरल वेक्टर pLKO.1-puro में डाला गया था।ShSLC7A5 के एंटीसेंस अनुक्रम इस प्रकार हैं: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′)।SLC7A5 (#5347) और ट्यूबुलिन (#2148) के एंटीबॉडी सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी से खरीदे गए थे।वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण के लिए SLC7A5 और ट्यूबुलिन के एंटीबॉडी का उपयोग 1:1000 के तनुकरण पर किया गया था।
सीहॉर्स एक्सएफ ग्लाइकोलाइटिक स्ट्रेस टेस्ट बाह्यकोशिकीय अम्लीकरण (ईसीएआर) स्तर को मापता है।परख में, ईसीएआर द्वारा मापी गई सेलुलर ग्लाइकोलाइटिक क्षमता का परीक्षण करने के लिए ग्लूकोज, ऑलिगोमाइसिन ए और 2-डीजी को क्रमिक रूप से प्रशासित किया गया था।
गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण (NC) और shSLC7A5 (Sh1, Sh2) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट A549 कोशिकाओं को 10 सेमी व्यास के बर्तन में रात भर चढ़ाया गया।सेल मेटाबोलाइट्स को 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा 80% जलीय मेथनॉल के साथ निकाला गया था।मेथनॉल समाधान में कोशिकाओं को हटा दिया गया, एक नई ट्यूब में एकत्र किया गया, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15,000 × जी पर सेंट्रीफ्यूज किया गया।800 μl सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें और एक उच्च गति वाले वैक्यूम सांद्रक का उपयोग करके सुखाएं।ऊपर बताए अनुसार एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग करके सूखे मेटाबोलाइट छर्रों का ट्रिप्टोफैन स्तर के लिए विश्लेषण किया गया।A549 कोशिकाओं (NC और shSLC7A5) में सेलुलर NAD(H) स्तर को निर्माता के निर्देशों के अनुसार मात्रात्मक NAD+/NADH वर्णमिति किट (#K337, BioVision) का उपयोग करके मापा गया था।मेटाबोलाइट्स की मात्रा को सामान्य करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए प्रोटीन का स्तर मापा गया।
नमूना आकार को प्रारंभिक रूप से निर्धारित करने के लिए किसी भी सांख्यिकीय तरीकों का उपयोग नहीं किया गया था।बायोमार्कर खोज15,18 के उद्देश्य से किए गए पिछले मेटाबोलॉमिक्स अध्ययनों को आकार निर्धारण के लिए बेंचमार्क माना गया है, और इन रिपोर्टों की तुलना में, हमारा नमूना पर्याप्त था।अध्ययन समूह से कोई भी नमूना बाहर नहीं रखा गया।अलक्षित मेटाबोलॉमिक्स अध्ययन के लिए सीरम नमूनों को यादृच्छिक रूप से एक खोज समूह (306 मामले, 74.6%) और एक आंतरिक सत्यापन समूह (104 मामले, 25.4%) को सौंपा गया था।हमने लक्षित चयापचय अध्ययन के लिए खोज सेट से प्रत्येक समूह से यादृच्छिक रूप से 70 मामलों का चयन किया।एलसी-एमएस डेटा संग्रह और विश्लेषण के दौरान जांचकर्ताओं को समूह असाइनमेंट के प्रति अंधा कर दिया गया था।मेटाबोलॉमिक्स डेटा और सेल प्रयोगों के सांख्यिकीय विश्लेषण संबंधित परिणाम, चित्रा किंवदंतियों और विधियों अनुभागों में वर्णित हैं।सेलुलर ट्रिप्टोफैन, एनएडीटी और ग्लाइकोलाइटिक गतिविधि की मात्रा का निर्धारण समान परिणामों के साथ तीन बार स्वतंत्र रूप से किया गया था।
अध्ययन डिज़ाइन के बारे में अधिक जानकारी के लिए, इस आलेख से संबद्ध प्राकृतिक पोर्टफोलियो रिपोर्ट सार देखें।
निकाली गई विशेषताओं का कच्चा एमएस डेटा और संदर्भ सीरम का सामान्यीकृत एमएस डेटा क्रमशः पूरक डेटा 1 और पूरक डेटा 2 में दिखाया गया है।विभेदक विशेषताओं के लिए शीर्ष एनोटेशन पूरक डेटा 3 में प्रस्तुत किए गए हैं। LUAD TCGA डेटासेट को https://portal.gdc.cancer.gov/ से डाउनलोड किया जा सकता है।ग्राफ़ को प्लॉट करने के लिए इनपुट डेटा स्रोत डेटा में प्रदान किया गया है।इस आलेख के लिए स्रोत डेटा प्रदान किया गया है।
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