मेटाबोलॉमिक्स रोगी के सीरम के उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण का उपयोग करके उच्च विशिष्टता के साथ सौम्य और घातक फुफ्फुसीय गांठों में अंतर करने में सक्षम है।

कंप्यूटेड टोमोग्राफी (CT) द्वारा पहचाने गए फुफ्फुसीय नोड्यूल्स का विभेदक निदान नैदानिक ​​अभ्यास में एक चुनौती बना हुआ है। यहाँ, हम 480 सीरम नमूनों के वैश्विक मेटाबोलोम का विश्लेषण करते हैं, जिनमें स्वस्थ नियंत्रण, सौम्य फेफड़े के नोड्यूल्स और स्टेज I फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा शामिल हैं। एडेनोकार्सिनोमा अद्वितीय मेटाबोलॉमिक प्रोफाइल प्रदर्शित करते हैं, जबकि सौम्य नोड्यूल्स और स्वस्थ व्यक्तियों के मेटाबोलॉमिक प्रोफाइल में उच्च समानता पाई जाती है। खोज समूह (n = 306) में, सौम्य और घातक नोड्यूल्स के बीच अंतर करने के लिए 27 मेटाबोलाइट्स का एक समूह पहचाना गया। आंतरिक सत्यापन (n = 104) और बाह्य सत्यापन (n = 111) समूहों में विभेदक मॉडल का AUC क्रमशः 0.915 और 0.945 था। पाथवे विश्लेषण से पता चला कि सौम्य गांठों और स्वस्थ व्यक्तियों की तुलना में फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा सीरम में ट्रिप्टोफैन की कमी के साथ ग्लाइकोलिटिक मेटाबोलाइट्स की मात्रा बढ़ी हुई थी, और इससे यह संकेत मिलता है कि ट्रिप्टोफैन का अवशोषण फेफड़े के कैंसर कोशिकाओं में ग्लाइकोलिसिस को बढ़ावा देता है। हमारा अध्ययन सीटी स्कैन द्वारा पता लगाए गए फुफ्फुसीय गांठों के जोखिम का आकलन करने में सीरम मेटाबोलाइट बायोमार्कर के महत्व को उजागर करता है।
कैंसर रोगियों की उत्तरजीविता दर में सुधार के लिए प्रारंभिक निदान अत्यंत महत्वपूर्ण है। अमेरिकी राष्ट्रीय फेफड़े के कैंसर स्क्रीनिंग परीक्षण (एनएलएसटी) और यूरोपीय नेल्सन अध्ययन के परिणामों से पता चला है कि कम खुराक वाली कंप्यूटेड टोमोग्राफी (एलडीसीटी) से स्क्रीनिंग करने पर उच्च जोखिम वाले समूहों में फेफड़े के कैंसर से होने वाली मृत्यु दर में उल्लेखनीय कमी आ सकती है1,2,3। फेफड़े के कैंसर की स्क्रीनिंग के लिए एलडीसीटी के व्यापक उपयोग के बाद से, लक्षणहीन फुफ्फुसीय गांठों के आकस्मिक रेडियोग्राफिक निष्कर्षों की घटनाएँ लगातार बढ़ रही हैं4। फुफ्फुसीय गांठों को 3 सेमी व्यास तक के फोकल अपारदर्शिता के रूप में परिभाषित किया जाता है5। हमें घातकता की संभावना का आकलन करने और एलडीसीटी पर आकस्मिक रूप से पता चलने वाली बड़ी संख्या में फुफ्फुसीय गांठों से निपटने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है। सीटी की सीमाओं के कारण बार-बार अनुवर्ती जांच और गलत-सकारात्मक परिणाम हो सकते हैं, जिससे अनावश्यक हस्तक्षेप और अतिउपचार हो सकता है6। इसलिए, प्रारंभिक चरणों में फेफड़े के कैंसर की सही पहचान करने और प्रारंभिक पहचान में अधिकांश सौम्य गांठों को अलग करने के लिए विश्वसनीय और उपयोगी बायोमार्कर विकसित करने की आवश्यकता है7।
रक्त (सीरम, प्लाज्मा, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं) के व्यापक आणविक विश्लेषण, जिसमें जीनोमिक्स, प्रोटीओमिक्स या डीएनए मेथाइलेशन8,9,10 शामिल हैं, ने फेफड़ों के कैंसर के लिए नैदानिक ​​बायोमार्कर की खोज में बढ़ती रुचि पैदा की है। वहीं, मेटाबोलॉमिक्स दृष्टिकोण उन कोशिकीय अंतिम उत्पादों को मापते हैं जो अंतर्जात और बहिर्जात क्रियाओं से प्रभावित होते हैं और इसलिए रोग की शुरुआत और परिणाम की भविष्यवाणी करने के लिए लागू होते हैं। लिक्विड क्रोमेटोग्राफी-टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) अपनी उच्च संवेदनशीलता और व्यापक गतिशील रेंज के कारण मेटाबोलॉमिक्स अध्ययनों के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है, जो विभिन्न भौतिक रासायनिक गुणों वाले मेटाबोलाइट्स को कवर कर सकती है11,12,13। हालांकि प्लाज्मा/सीरम के वैश्विक मेटाबोलॉमिक विश्लेषण का उपयोग फेफड़ों के कैंसर के निदान14,15,16,17 और उपचार प्रभावकारिता18 से जुड़े बायोमार्कर की पहचान करने के लिए किया गया है, सौम्य और घातक फेफड़ों की गांठों के बीच अंतर करने के लिए सीरम मेटाबोलाइट क्लासिफायर का अभी भी व्यापक अध्ययन किया जाना बाकी है।
एडेनोकार्सिनोमा और स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा, नॉन-स्मॉल सेल लंग कैंसर (एनएससीएलसी) के दो मुख्य उपप्रकार हैं। विभिन्न सीटी स्कैन स्क्रीनिंग परीक्षणों से पता चलता है कि एडेनोकार्सिनोमा फेफड़ों के कैंसर का सबसे आम ऊतकीय प्रकार है1,19,20,21। इस अध्ययन में, हमने स्वस्थ व्यक्तियों, सौम्य फुफ्फुसीय गांठों और सीटी स्कैन द्वारा पता लगाए गए ≤3 सेमी आकार के स्टेज I फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा की स्क्रीनिंग के लिए कुल 695 सीरम नमूनों पर मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण करने के लिए अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-हाई-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (यूपीएलसी-एचआरएमएस) का उपयोग किया। हमने सीरम मेटाबोलाइट्स का एक पैनल पहचाना जो फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा को सौम्य गांठों और स्वस्थ व्यक्तियों से अलग करता है। पाथवे एनरिचमेंट विश्लेषण से पता चला कि सौम्य गांठों और स्वस्थ व्यक्तियों की तुलना में फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा में असामान्य ट्रिप्टोफैन और ग्लूकोज चयापचय में सामान्य परिवर्तन पाए जाते हैं। अंत में, हमने एलडीसीटी द्वारा पता लगाए गए घातक और सौम्य फुफ्फुसीय नोड्यूल्स के बीच अंतर करने के लिए उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता वाले सीरम मेटाबोलिक क्लासिफायर की स्थापना और सत्यापन किया, जो प्रारंभिक विभेदक निदान और जोखिम मूल्यांकन में सहायता कर सकता है।
वर्तमान अध्ययन में, लिंग और आयु के आधार पर मेल खाने वाले सीरम के नमूने 174 स्वस्थ व्यक्तियों, 292 सौम्य फुफ्फुसीय गांठ वाले रोगियों और चरण I फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा वाले 229 रोगियों से पूर्वव्यापी रूप से एकत्र किए गए थे। 695 विषयों की जनसांख्यिकीय विशेषताओं को अनुपूरक तालिका 1 में दर्शाया गया है।
चित्र 1a में दर्शाए अनुसार, सन यात-सेन विश्वविद्यालय कैंसर केंद्र में कुल 480 सीरम नमूने एकत्र किए गए, जिनमें 174 स्वस्थ नियंत्रण (HC), 170 सौम्य गांठें (BN) और 136 चरण I फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा (LA) के नमूने शामिल थे। अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-हाई-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UPLC-HRMS) का उपयोग करके लक्षित मेटाबोलोमिक प्रोफाइलिंग के लिए डिस्कवरी कोहोर्ट का उपयोग किया गया। जैसा कि अनुपूरक चित्र 1 में दर्शाया गया है, LA और HC तथा LA और BN के बीच विभेदक मेटाबोलाइट्स की पहचान एक वर्गीकरण मॉडल स्थापित करने और विभेदक मार्ग विश्लेषण का आगे पता लगाने के लिए की गई थी। सन यात-सेन विश्वविद्यालय कैंसर केंद्र द्वारा एकत्र किए गए 104 नमूनों और दो अन्य अस्पतालों द्वारा एकत्र किए गए 111 नमूनों का क्रमशः आंतरिक और बाह्य सत्यापन किया गया।
अध्ययन समूह में शामिल जनसंख्या, जिसका अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-हाई-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UPLC-HRMS) का उपयोग करके वैश्विक सीरम मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण किया गया। b अध्ययन समूह से लिए गए 480 सीरम नमूनों के कुल मेटाबोलोम का आंशिक न्यूनतम वर्ग विभेदक विश्लेषण (PLS-DA), जिसमें स्वस्थ नियंत्रण (HC, n = 174), सौम्य नोड्यूल (BN, n = 170), और चरण I फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा (लॉस एंजिल्स, n = 136) शामिल हैं। +ESI, सकारात्मक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मोड, -ESI, नकारात्मक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मोड। c–e दो दिए गए समूहों में महत्वपूर्ण रूप से भिन्न प्रचुरता वाले मेटाबोलाइट्स (दो-तरफ़ा विल्कोक्सन साइन्ड रैंक परीक्षण, गलत खोज दर समायोजित p मान, FDR <0.05) को लाल (फोल्ड परिवर्तन > 1.2) और नीले (फोल्ड परिवर्तन < 0.83) रंग में दर्शाया गया है। ज्वालामुखी ग्राफ़िक पर दिखाया गया है। f. पदानुक्रमित क्लस्टरिंग हीट मैप LA और BN के बीच एनोटेटेड मेटाबोलाइट्स की संख्या में महत्वपूर्ण अंतर दर्शाता है। स्रोत डेटा स्रोत डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रदान किया गया है।
खोज समूह में शामिल 174 एचसी, 170 बीएन और 136 एलए के कुल सीरम मेटाबोलोम का विश्लेषण यूपीएलसी-एचआरएमएस विश्लेषण का उपयोग करके किया गया। हमने सबसे पहले यह दिखाया कि गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) नमूने एक अनसुपरवाइज्ड प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस (पीसीए) मॉडल के केंद्र में मजबूती से क्लस्टर बनाते हैं, जो वर्तमान अध्ययन के प्रदर्शन की स्थिरता की पुष्टि करता है (पूरक चित्र 2)।
चित्र 1b में आंशिक न्यूनतम वर्ग-भेदभाव विश्लेषण (PLS-DA) द्वारा दर्शाए अनुसार, हमने पाया कि सकारात्मक (+ESI) और नकारात्मक (−ESI) इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मोड में LA और BN तथा LA और HC के बीच स्पष्ट अंतर थे। हालांकि, +ESI और -ESI स्थितियों में BN और HC के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया।
हमने LA और HC के बीच 382 विभेदक विशेषताएँ, LA और BN के बीच 231 विभेदक विशेषताएँ और BN और HC के बीच 95 विभेदक विशेषताएँ पाईं (विलकॉक्सन साइन्ड रैंक टेस्ट, FDR <0.05 और मल्टीपल चेंज >1.2 या <0.83) (चित्र 1c-e)। पीक्स को m/z मान, प्रतिधारण समय और विखंडन द्रव्यमान स्पेक्ट्रम खोज (विवरण विधि अनुभाग में वर्णित है) 22 द्वारा एक डेटाबेस (mzCloud/HMDB/Chemspider लाइब्रेरी) के विरुद्ध आगे एनोटेट किया गया (पूरक डेटा 3)। अंत में, LA बनाम BN (चित्र 1f और पूरक तालिका 2) और LA बनाम HC (पूरक चित्र 3 और पूरक तालिका 2) के लिए प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर वाले 33 और 38 एनोटेट किए गए मेटाबोलाइट्स की पहचान की गई। इसके विपरीत, BN और HC में प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर वाले केवल 3 मेटाबोलाइट्स की पहचान की गई (पूरक तालिका 2), जो PLS-DA में BN और HC के बीच ओवरलैप के अनुरूप है। ये विभेदक मेटाबोलाइट्स जैव रसायनों की एक विस्तृत श्रृंखला को कवर करते हैं (पूरक चित्र 4)। कुल मिलाकर, ये परिणाम सीरम मेटाबोलोम में महत्वपूर्ण परिवर्तनों को दर्शाते हैं जो सौम्य फेफड़ों की गांठों या स्वस्थ व्यक्तियों की तुलना में प्रारंभिक चरण के फेफड़ों के कैंसर के घातक रूपांतरण को प्रतिबिंबित करते हैं। इस बीच, बीएन और एचसी के सीरम मेटाबोलोम की समानता से पता चलता है कि सौम्य फुफ्फुसीय गांठें स्वस्थ व्यक्तियों के साथ कई जैविक विशेषताओं को साझा कर सकती हैं। यह देखते हुए कि फेफड़ों के एडेनोकार्सिनोमा उपप्रकार 23 में एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) जीन उत्परिवर्तन आम हैं, हमने सीरम मेटाबोलोम पर चालक उत्परिवर्तनों के प्रभाव को निर्धारित करने का प्रयास किया। फिर हमने फेफड़ों के एडेनोकार्सिनोमा समूह में ईजीएफआर स्थिति वाले 72 मामलों के समग्र मेटाबोलोमिक प्रोफाइल का विश्लेषण किया। दिलचस्प बात यह है कि पीसीए विश्लेषण (पूरक चित्र 5ए) में हमें ईजीएफआर उत्परिवर्ती रोगियों (एन = 41) और ईजीएफआर वाइल्ड-टाइप रोगियों (एन = 31) के बीच तुलनीय प्रोफाइल मिले। हालांकि, हमने 7 ऐसे मेटाबोलाइट्स की पहचान की जिनकी प्रचुरता, वाइल्ड-टाइप EGFR वाले रोगियों की तुलना में EGFR म्यूटेशन वाले रोगियों में काफी बदल गई थी (टी टेस्ट, p < 0.05 और फोल्ड चेंज > 1.2 या < 0.83) (पूरक चित्र 5b)। इनमें से अधिकांश मेटाबोलाइट्स (7 में से 5) एसिल्कार्निटाइन हैं, जो फैटी एसिड ऑक्सीकरण मार्गों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।
चित्र 2a में दर्शाए गए कार्यप्रवाह के अनुसार, नोड्यूल वर्गीकरण के लिए बायोमार्कर न्यूनतम निरपेक्ष संकुचन ऑपरेटरों का उपयोग करके और LA (n = 136) और BN (n = 170) में पहचाने गए 33 विभेदक मेटाबोलाइट्स के आधार पर चयन करके प्राप्त किए गए थे। चरों का सर्वोत्तम संयोजन (LASSO) – बाइनरी लॉजिस्टिक रिग्रेशन मॉडल का उपयोग किया गया। मॉडल की विश्वसनीयता का परीक्षण करने के लिए दस गुना क्रॉस-वैलिडेशन का उपयोग किया गया। चर चयन और पैरामीटर नियमितीकरण को पैरामीटर λ24 के साथ संभावना अधिकतमकरण दंड द्वारा समायोजित किया गया। विभेदक मॉडल के वर्गीकरण प्रदर्शन का परीक्षण करने के लिए आंतरिक सत्यापन (n = 104) और बाहरी सत्यापन (n = 111) समूहों में स्वतंत्र रूप से वैश्विक मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण किया गया। परिणामस्वरूप, खोज सेट में 27 मेटाबोलाइट्स को सबसे बड़े औसत AUC मान (चित्र 2b) के साथ सर्वश्रेष्ठ विभेदक मॉडल के रूप में पहचाना गया, जिनमें से 9 की गतिविधि LA में BN की तुलना में बढ़ी हुई थी और 18 की गतिविधि घटी हुई थी (चित्र 2c)।
पल्मोनरी नोड्यूल क्लासिफायर बनाने की कार्यप्रणाली, जिसमें दस-गुना क्रॉस-वैलिडेशन के माध्यम से बाइनरी लॉजिस्टिक रिग्रेशन मॉडल का उपयोग करके डिस्कवरी सेट में सीरम मेटाबोलाइट्स के सर्वोत्तम पैनल का चयन करना और आंतरिक और बाहरी वैलिडेशन सेट में पूर्वानुमान प्रदर्शन का मूल्यांकन करना शामिल है। b मेटाबोलिक बायोमार्कर चयन के लिए LASSO रिग्रेशन मॉडल के क्रॉस-वैलिडेशन आँकड़े। ऊपर दिए गए अंक एक दिए गए λ पर चयनित बायोमार्करों की औसत संख्या दर्शाते हैं। लाल बिंदीदार रेखा संबंधित लैम्डा पर औसत AUC मान दर्शाती है। धूसर त्रुटि बार न्यूनतम और अधिकतम AUC मान दर्शाते हैं। बिंदीदार रेखा 27 चयनित बायोमार्करों वाले सर्वोत्तम मॉडल को इंगित करती है। AUC, रिसीवर ऑपरेटिंग कैरेक्टरिस्टिक (ROC) वक्र के अंतर्गत क्षेत्र। c डिस्कवरी समूह में BN समूह की तुलना में LA समूह में 27 चयनित मेटाबोलाइट्स के गुना परिवर्तन। लाल स्तंभ – सक्रियण। नीला स्तंभ गिरावट दर्शाता है। चित्र d–f में रिसीवर ऑपरेटिंग कैरेक्टरिस्टिक (ROC) वक्र दर्शाए गए हैं जो खोज, आंतरिक और बाह्य सत्यापन सेटों में 27 मेटाबोलाइट संयोजनों पर आधारित विभेदक मॉडल की क्षमता को प्रदर्शित करते हैं। स्रोत डेटा स्रोत डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रदान किया गया है।
इन 27 मेटाबोलाइट्स के भारित प्रतिगमन गुणांकों के आधार पर एक पूर्वानुमान मॉडल बनाया गया (पूरक तालिका 3)। इन 27 मेटाबोलाइट्स पर आधारित ROC विश्लेषण से वक्र के नीचे का क्षेत्र (AUC) मान 0.933, खोज समूह संवेदनशीलता 0.868 और विशिष्टता 0.859 प्राप्त हुई (चित्र 2d)। इसी बीच, LA और HC के बीच 38 एनोटेटेड विभेदक मेटाबोलाइट्स में से, 16 मेटाबोलाइट्स के एक समूह ने LA को HC से अलग करने में 0.902 का AUC, 0.801 की संवेदनशीलता और 0.856 की विशिष्टता प्राप्त की (पूरक चित्र 6a-c)। विभेदक मेटाबोलाइट्स के लिए विभिन्न फोल्ड परिवर्तन थ्रेशोल्ड के आधार पर AUC मानों की भी तुलना की गई। हमने पाया कि वर्गीकरण मॉडल ने LA और BN (HC) के बीच अंतर करने में तब सबसे अच्छा प्रदर्शन किया जब फोल्ड परिवर्तन स्तर 1.2 बनाम 1.5 या 2.0 पर सेट किया गया था (पूरक चित्र 7a,b)। 27 मेटाबोलाइट समूहों पर आधारित वर्गीकरण मॉडल को आंतरिक और बाह्य समूहों में आगे मान्य किया गया। आंतरिक सत्यापन के लिए AUC 0.915 (संवेदनशीलता 0.867, विशिष्टता 0.811) और बाह्य सत्यापन के लिए 0.945 (संवेदनशीलता 0.810, विशिष्टता 0.979) था (चित्र 2e, f)। अंतर-प्रयोगशाला दक्षता का आकलन करने के लिए, बाह्य समूह के 40 नमूनों का विश्लेषण एक बाह्य प्रयोगशाला में किया गया, जैसा कि विधि अनुभाग में वर्णित है। वर्गीकरण सटीकता ने 0.925 का AUC प्राप्त किया (पूरक चित्र 8)। चूंकि फेफड़े का स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (LUSC) फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा (LUAD) के बाद गैर-छोटे सेल फेफड़े के कैंसर (NSCLC) का दूसरा सबसे आम उपप्रकार है, इसलिए हमने चयापचय प्रोफाइल की मान्य संभावित उपयोगिता का भी परीक्षण किया। BN और LUSC के 16 मामले। LUSC और BN के बीच भेदभाव का AUC 0.776 था (पूरक चित्र 9), जो LUAD और BN के बीच भेदभाव की तुलना में खराब क्षमता को दर्शाता है।
अध्ययनों से पता चला है कि सीटी स्कैन छवियों पर गांठों का आकार दुर्दमता की संभावना से सकारात्मक रूप से संबंधित है और गांठों के उपचार का एक प्रमुख निर्धारक बना हुआ है25,26,27। नेल्सन स्क्रीनिंग अध्ययन के बड़े समूह से प्राप्त आंकड़ों के विश्लेषण से पता चला है कि 5 मिमी से कम आकार की गांठों वाले विषयों में दुर्दमता का जोखिम उन विषयों के समान था जिनमें गांठें नहीं थीं28। इसलिए, नियमित सीटी निगरानी के लिए आवश्यक न्यूनतम आकार ब्रिटिश थोरेसिक सोसाइटी (बीटीएस) द्वारा अनुशंसित 5 मिमी और फ्लेशनेर सोसाइटी द्वारा अनुशंसित 6 मिमी है29। हालांकि, 6 मिमी से बड़ी और स्पष्ट सौम्य विशेषताओं के बिना गांठें, जिन्हें अनिश्चित फुफ्फुसीय गांठें (आईपीएन) कहा जाता है, नैदानिक ​​अभ्यास में मूल्यांकन और प्रबंधन में एक बड़ी चुनौती बनी हुई हैं30,31। इसके बाद हमने यह जांच की कि क्या गांठ का आकार खोज और आंतरिक सत्यापन समूहों से एकत्रित नमूनों का उपयोग करके मेटाबोलॉमिक संकेतों को प्रभावित करता है। 27 मान्य बायोमार्करों पर ध्यान केंद्रित करते हुए, हमने सबसे पहले HC और BN के 6 मिमी से कम आकार के मेटाबोलोम के PCA प्रोफाइल की तुलना की। हमने पाया कि HC और BN के अधिकांश डेटा बिंदु ओवरलैप करते हैं, जिससे पता चलता है कि दोनों समूहों में सीरम मेटाबोलाइट स्तर समान थे (चित्र 3a)। विभिन्न आकार श्रेणियों में फीचर मैप BN और LA में संरक्षित रहे (चित्र 3b, c), जबकि 6-20 मिमी आकार की सीमा में घातक और सौम्य गांठों के बीच एक अलगाव देखा गया (चित्र 3d)। इस समूह में 6 से 20 मिमी आकार की गांठों की घातकता का पूर्वानुमान लगाने के लिए AUC 0.927, विशिष्टता 0.868 और संवेदनशीलता 0.820 थी (चित्र 3e, f)। हमारे परिणाम दर्शाते हैं कि यह क्लासिफायर गांठ के आकार की परवाह किए बिना, प्रारंभिक घातक परिवर्तन के कारण होने वाले चयापचय परिवर्तनों को पकड़ सकता है।
ad 27 मेटाबोलाइट्स के मेटाबोलिक क्लासिफायर के आधार पर निर्दिष्ट समूहों के बीच पीसीए प्रोफाइल की तुलना। सीसी और बीएन < 6 मिमी। b बीएन < 6 मिमी बनाम बीएन 6–20 मिमी। एलए 6–20 मिमी बनाम एलए 20–30 मिमी। g बीएन 6–20 मिमी और एलए 6–20 मिमी। जीसी, n = 174; बीएन < 6 मिमी, n = 153; बीएन 6–20 मिमी, n = 91; एलए 6–20 मिमी, n = 89; एलए 20–30 मिमी, n = 77। e रिसीवर ऑपरेटिंग कैरेक्टरिस्टिक (आरओसी) वक्र 6–20 मिमी के नोड्यूल्स के लिए विभेदक मॉडल प्रदर्शन को दर्शाता है। f 6–20 मिमी के नोड्यूल्स के लिए लॉजिस्टिक रिग्रेशन मॉडल के आधार पर प्रायिकता मानों की गणना की गई। धूसर बिंदीदार रेखा इष्टतम कटऑफ मान (0.455) को दर्शाती है। ऊपर दिए गए आंकड़े लॉस एंजिल्स के लिए अनुमानित मामलों का प्रतिशत दर्शाते हैं। दो-पूंछ वाले स्टूडेंट के टी-टेस्ट का उपयोग करें। पीसीए, प्रमुख घटक विश्लेषण। एयूसी वक्र के नीचे का क्षेत्र है। स्रोत डेटा स्रोत डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रदान किया गया है।
समान फुफ्फुसीय गांठों के आकार (7-9 मिमी) वाले चार नमूनों (उम्र 44-61 वर्ष) को प्रस्तावित दुर्दमता पूर्वानुमान मॉडल के प्रदर्शन को दर्शाने के लिए चुना गया (चित्र 4a, b)। प्रारंभिक जांच में, केस 1 में कैल्सीफिकेशन के साथ एक ठोस गांठ पाई गई, जो सौम्यता से जुड़ी एक विशेषता है, जबकि केस 2 में कोई स्पष्ट सौम्य लक्षण न दिखाने वाली एक अनिर्धारित आंशिक रूप से ठोस गांठ पाई गई। तीन दौर के अनुवर्ती सीटी स्कैन से पता चला कि ये मामले 4 वर्षों की अवधि में स्थिर रहे और इसलिए इन्हें सौम्य गांठ माना गया (चित्र 4a)। क्रमिक सीटी स्कैन के नैदानिक ​​मूल्यांकन की तुलना में, वर्तमान क्लासिफायर मॉडल के साथ एकल-शॉट सीरम मेटाबोलाइट विश्लेषण ने संभाव्यता संबंधी बाधाओं के आधार पर इन सौम्य गांठों की शीघ्रता और सटीकता से पहचान की (तालिका 1)। केस 3 में चित्र 4b में फुफ्फुसीय संकुचन के संकेतों वाली एक गांठ दिखाई गई है, जो अक्सर दुर्दमता32 से जुड़ी होती है। केस 4 एक अनिर्धारित आंशिक रूप से ठोस गांठ के रूप में प्रस्तुत किया गया था, जिसमें सौम्य कारण का कोई प्रमाण नहीं था। इन सभी मामलों को क्लासिफायर मॉडल के अनुसार घातक होने का अनुमान लगाया गया था (तालिका 1)। फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा का आकलन फेफड़े के रिसेक्शन सर्जरी के बाद हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षण द्वारा प्रदर्शित किया गया था (चित्र 4b)। बाहरी सत्यापन सेट के लिए, मेटाबोलिक क्लासिफायर ने 6 मिमी से बड़ी दो अनिर्धारित फेफड़े की गांठों का सटीक अनुमान लगाया (पूरक चित्र 10)।
दो मामलों में सौम्य गांठों के फेफड़ों के अक्षीय विंडो के सीटी स्कैन चित्र। पहले मामले में, 4 साल बाद किए गए सीटी स्कैन में दाहिने निचले लोब में 7 मिमी आकार की एक स्थिर ठोस गांठ दिखाई दी, जिसमें कैल्सीफिकेशन था। दूसरे मामले में, 5 साल बाद किए गए सीटी स्कैन में दाहिने ऊपरी लोब में 7 मिमी व्यास की एक स्थिर, आंशिक रूप से ठोस गांठ दिखाई दी। b फेफड़ों के अक्षीय विंडो सीटी स्कैन चित्र और फेफड़ों के उच्छेदन से पहले चरण I एडेनोकार्सिनोमा के दो मामलों के संबंधित पैथोलॉजिकल अध्ययन। तीसरे मामले में दाहिने ऊपरी लोब में 8 मिमी व्यास की एक गांठ दिखाई दी, जिसमें फुफ्फुसीय संकुचन था। चौथे मामले में बाएं ऊपरी लोब में 9 मिमी आकार की एक आंशिक रूप से ठोस ग्राउंड-ग्लास गांठ दिखाई दी। उच्छेदित फेफड़े के ऊतक की हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन (H&E) स्टेनिंग (स्केल बार = 50 μm) फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के एसिनर वृद्धि पैटर्न को दर्शाती है। तीर सीटी चित्रों में पाई गई गांठों को इंगित करते हैं। एच एंड ई छवियां पैथोलॉजिस्ट द्वारा जांचे गए कई (>3) सूक्ष्म क्षेत्रों की प्रतिनिधि छवियां हैं।
कुल मिलाकर, हमारे परिणाम फुफ्फुसीय गांठों के विभेदक निदान में सीरम मेटाबोलाइट बायोमार्करों के संभावित मूल्य को प्रदर्शित करते हैं, जो सीटी स्क्रीनिंग का मूल्यांकन करते समय चुनौतियां पेश कर सकते हैं।
मान्यीकृत विभेदक मेटाबोलाइट पैनल के आधार पर, हमने प्रमुख चयापचय परिवर्तनों के जैविक सहसंबंधों की पहचान करने का प्रयास किया। मेटाबोएनालिस्ट द्वारा किए गए KEGG पाथवे संवर्धन विश्लेषण ने दिए गए दो समूहों (LA बनाम HC और LA बनाम BN, समायोजित p ≤ 0.001, प्रभाव > 0.01) के बीच 6 सामान्य रूप से महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित पाथवे की पहचान की। इन परिवर्तनों की विशेषता पाइरुवेट चयापचय, ट्रिप्टोफैन चयापचय, नियासिन और निकोटिनमाइड चयापचय, ग्लाइकोलिसिस, TCA चक्र और प्यूरीन चयापचय में गड़बड़ी थी (चित्र 5a)। इसके बाद हमने पूर्ण मात्रा निर्धारण का उपयोग करके प्रमुख परिवर्तनों को सत्यापित करने के लिए लक्षित मेटाबोलोमिक्स किया। प्रामाणिक मेटाबोलाइट मानकों का उपयोग करके ट्रिपल क्वाड्रुपोल मास स्पेक्ट्रोमेट्री (QQQ) द्वारा सामान्य रूप से परिवर्तित पाथवे में सामान्य मेटाबोलाइट्स का निर्धारण किया गया। मेटाबोलॉमिक्स अध्ययन के लक्षित नमूने की जनसांख्यिकीय विशेषताओं को अनुपूरक तालिका 4 में शामिल किया गया है। हमारे वैश्विक मेटाबोलॉमिक्स परिणामों के अनुरूप, मात्रात्मक विश्लेषण ने पुष्टि की कि हाइपोक्सैंथिन और ज़ैंथिन, पाइरुवेट और लैक्टेट, बीएन और एचसी की तुलना में एलए में बढ़े हुए थे (चित्र 5बी, सी, पी <0.05)। हालांकि, बीएन और एचसी के बीच इन मेटाबोलाइट्स में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया।
LA समूह में BN और HC समूहों की तुलना में महत्वपूर्ण रूप से भिन्न मेटाबोलाइट्स के KEGG पाथवे संवर्धन विश्लेषण का उपयोग किया गया। दो-तरफ़ा ग्लोबलटेस्ट का उपयोग किया गया, और p मानों को होल्म-बोनफेरोनी विधि (समायोजित p ≤ 0.001 और प्रभाव आकार > 0.01) का उपयोग करके समायोजित किया गया। b–d वायलिन प्लॉट सीरम HC, BN और LA में हाइपोक्सैंथिन, ज़ैंथिन, लैक्टेट, पाइरुवेट और ट्रिप्टोफैन के स्तर को दर्शाते हैं, जिन्हें LC-MS/MS द्वारा निर्धारित किया गया है (प्रत्येक समूह में n = 70)। सफेद और काली बिंदीदार रेखाएँ क्रमशः माध्यिका और चतुर्थक को दर्शाती हैं। e वायलिन प्लॉट LUAD-TCGA डेटासेट में सामान्य फेफड़े के ऊतक (n = 59) की तुलना में फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा (n = 513) में SLC7A5 और QPRT के सामान्यीकृत Log2TPM (प्रति मिलियन प्रतिलेख) mRNA अभिव्यक्ति को दर्शाता है। सफेद बॉक्स अंतरचतुर्थक सीमा को दर्शाता है, केंद्र में क्षैतिज काली रेखा माध्यिका को दर्शाती है, और बॉक्स से फैली ऊर्ध्वाधर काली रेखा 95% विश्वास अंतराल (CI) को दर्शाती है। f TCGA डेटासेट में फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा (n = 513) और सामान्य फेफड़े के ऊतक (n = 59) में SLC7A5 और GAPDH अभिव्यक्ति का पियर्सन सहसंबंध प्लॉट। धूसर क्षेत्र 95% CI को दर्शाता है। r, पियर्सन सहसंबंध गुणांक। g LC-MS/MS द्वारा निर्धारित गैर-विशिष्ट shRNA नियंत्रण (NC) और shSLC7A5 (Sh1, Sh2) से ट्रांसफेक्टेड A549 कोशिकाओं में सामान्यीकृत कोशिकीय ट्रिप्टोफैन स्तर। प्रत्येक समूह में पांच जैविक रूप से स्वतंत्र नमूनों का सांख्यिकीय विश्लेषण प्रस्तुत किया गया है। h A549 कोशिकाओं (NC) और SLC7A5 नॉकडाउन A549 कोशिकाओं (Sh1, Sh2) में NADt (कुल NAD, जिसमें NAD+ और NADH शामिल हैं) के कोशिकीय स्तर। प्रत्येक समूह में तीन जैविक रूप से स्वतंत्र नमूनों का सांख्यिकीय विश्लेषण प्रस्तुत किया गया है। i SLC7A5 नॉकडाउन से पहले और बाद में A549 कोशिकाओं की ग्लाइकोलिटिक गतिविधि को बाह्यकोशिकीय अम्लीकरण दर (ECAR) द्वारा मापा गया (प्रत्येक समूह में n = 4 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने)। 2-DG, 2-डीऑक्सी-D-ग्लूकोज। (b–h) में दो-पूंछ वाले स्टूडेंट के t परीक्षण का उपयोग किया गया था। (g–i) में, त्रुटि बार माध्य ± मानक विचलन को दर्शाते हैं, प्रत्येक प्रयोग तीन बार स्वतंत्र रूप से किया गया था और परिणाम समान थे। स्रोत डेटा स्रोत डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रदान किया गया है।
LA समूह में ट्रिप्टोफैन चयापचय में परिवर्तन के महत्वपूर्ण प्रभाव को देखते हुए, हमने QQQ का उपयोग करके HC, BN और LA समूहों में सीरम ट्रिप्टोफैन के स्तर का भी आकलन किया। हमने पाया कि HC या BN की तुलना में LA में सीरम ट्रिप्टोफैन का स्तर कम था (p < 0.001, चित्र 5d), जो पिछले निष्कर्षों के अनुरूप है कि फेफड़ों के कैंसर के रोगियों में परिसंचारी ट्रिप्टोफैन का स्तर स्वस्थ नियंत्रण समूह की तुलना में कम होता है33,34,35। PET/CT ट्रेसर 11C-मिथाइल-L-ट्रिप्टोफैन का उपयोग करने वाले एक अन्य अध्ययन में पाया गया कि फेफड़ों के कैंसर के ऊतकों में ट्रिप्टोफैन सिग्नल प्रतिधारण समय सौम्य घावों या सामान्य ऊतकों की तुलना में काफी बढ़ गया था36। हमारा अनुमान है कि LA सीरम में ट्रिप्टोफैन की कमी फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं द्वारा सक्रिय ट्रिप्टोफैन अवशोषण को दर्शा सकती है।
यह भी ज्ञात है कि ट्रिप्टोफैन कैटाबोलिज्म के काइनुरेनाइन मार्ग का अंतिम उत्पाद NAD+37,38 है, जो ग्लाइकोलिसिस39 में ग्लिसराल्डिहाइड-3-फॉस्फेट की 1,3-बिसफॉस्फोग्लिसरेट के साथ प्रतिक्रिया के लिए एक महत्वपूर्ण सब्सट्रेट है। जबकि पिछले अध्ययनों ने प्रतिरक्षा विनियमन में ट्रिप्टोफैन कैटाबोलिज्म की भूमिका पर ध्यान केंद्रित किया है, हमने वर्तमान अध्ययन में देखे गए ट्रिप्टोफैन डिसरेगुलेशन और ग्लाइकोलिटिक मार्गों के बीच परस्पर क्रिया को स्पष्ट करने का प्रयास किया। सॉल्यूट ट्रांसपोर्टर परिवार 7 सदस्य 5 (SLC7A5) को ट्रिप्टोफैन ट्रांसपोर्टर43,44,45 के रूप में जाना जाता है। क्विनोलिनिक एसिड फॉस्फोरिबोसिलट्रांसफरेज (QPRT) काइनुरेनाइन मार्ग के नीचे स्थित एक एंजाइम है जो क्विनोलिनिक एसिड को NAMN46 में परिवर्तित करता है। LUAD TCGA डेटासेट के निरीक्षण से पता चला कि सामान्य ऊतक की तुलना में ट्यूमर ऊतक में SLC7A5 और QPRT दोनों का स्तर काफी अधिक था (चित्र 5e)। यह वृद्धि फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के चरण I और II के साथ-साथ चरण III और IV में भी देखी गई (पूरक चित्र 11), जो ट्यूमरजनन से जुड़े ट्रिप्टोफैन चयापचय में प्रारंभिक गड़बड़ी का संकेत देती है।
इसके अतिरिक्त, LUAD-TCGA डेटासेट ने कैंसर रोगी के नमूनों में SLC7A5 और GAPDH mRNA अभिव्यक्ति के बीच एक सकारात्मक सहसंबंध दिखाया (r = 0.45, p = 1.55E-26, चित्र 5f)। इसके विपरीत, सामान्य फेफड़े के ऊतक में ऐसे जीन संकेतों के बीच कोई महत्वपूर्ण सहसंबंध नहीं पाया गया (r = 0.25, p = 0.06, चित्र 5f)। A549 कोशिकाओं में SLC7A5 के नॉकडाउन (पूरक चित्र 12) ने कोशिकीय ट्रिप्टोफैन और NAD(H) के स्तर को काफी कम कर दिया (चित्र 5g,h), जिसके परिणामस्वरूप बाह्यकोशिकीय अम्लीकरण दर (ECAR) द्वारा मापी गई ग्लाइकोलिटिक गतिविधि कम हो गई (चित्र 1, 5i)। इस प्रकार, सीरम में चयापचय परिवर्तनों और इन विट्रो पहचान के आधार पर, हम यह परिकल्पना करते हैं कि ट्रिप्टोफैन चयापचय किन्यूरिन मार्ग के माध्यम से NAD+ का उत्पादन कर सकता है और फेफड़े के कैंसर में ग्लाइकोलिसिस को बढ़ावा देने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है।
अध्ययनों से पता चला है कि एलडीसीटी द्वारा पता लगाए गए बड़ी संख्या में अनिर्धारित फुफ्फुसीय नोड्यूल्स के कारण पीईटी-सीटी, फेफड़े की बायोप्सी जैसे अतिरिक्त परीक्षण और दुर्दमता के गलत-सकारात्मक निदान के कारण अतिउपचार की आवश्यकता हो सकती है।31 जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है, हमारे अध्ययन ने संभावित नैदानिक ​​मूल्य वाले सीरम मेटाबोलाइट्स के एक पैनल की पहचान की है जो सीटी द्वारा पता लगाए गए फुफ्फुसीय नोड्यूल्स के जोखिम स्तरीकरण और बाद के प्रबंधन में सुधार कर सकता है।
फेफड़ों में मौजूद गांठों का मूल्यांकन कम खुराक वाली कंप्यूटेड टोमोग्राफी (एलडीसीटी) का उपयोग करके किया जाता है, जिसमें इमेजिंग विशेषताएं सौम्य या घातक कारणों का संकेत देती हैं। गांठों के अनिश्चित परिणाम के कारण बार-बार फॉलो-अप जांच, अनावश्यक हस्तक्षेप और अतिउपचार हो सकता है। नैदानिक ​​महत्व वाले सीरम मेटाबोलिक क्लासिफायर को शामिल करने से फेफड़ों की गांठों के जोखिम मूल्यांकन और उसके बाद के प्रबंधन में सुधार हो सकता है। पीईटी पॉज़िट्रॉन एमिशन टोमोग्राफी।
अमेरिका के एनएलएसटी अध्ययन और यूरोप के नेल्सन अध्ययन से प्राप्त आंकड़ों से पता चलता है कि कम खुराक वाली कंप्यूटेड टोमोग्राफी (एलडीसीटी) द्वारा उच्च जोखिम वाले समूहों की स्क्रीनिंग से फेफड़ों के कैंसर से होने वाली मृत्यु दर में कमी आ सकती है1,3। हालांकि, एलडीसीटी द्वारा पता लगाए गए बड़ी संख्या में आकस्मिक फुफ्फुसीय गांठों का जोखिम मूल्यांकन और उसके बाद का नैदानिक ​​प्रबंधन सबसे चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। मुख्य लक्ष्य विश्वसनीय बायोमार्करों को शामिल करके मौजूदा एलडीसीटी-आधारित प्रोटोकॉल के सही वर्गीकरण को अनुकूलित करना है।
फेफड़ों के कैंसर की तुलना स्वस्थ व्यक्तियों से करके कुछ आणविक जैवचिह्न, जैसे रक्त चयापचयक, की पहचान की गई है15,17। वर्तमान अध्ययन में, हमने एलडीसीटी द्वारा संयोगवश पाए गए सौम्य और घातक फुफ्फुसीय गांठों के बीच अंतर करने के लिए सीरम चयापचय विश्लेषण के अनुप्रयोग पर ध्यान केंद्रित किया। हमने यूपीएलसी-एचआरएमएस विश्लेषण का उपयोग करके स्वस्थ नियंत्रण (एचसी), सौम्य फेफड़ों की गांठों (बीएन) और चरण I फेफड़ों के एडेनोकार्सिनोमा (एलए) के नमूनों के समग्र सीरम चयापचय की तुलना की। हमने पाया कि एचसी और बीएन में समान चयापचय प्रोफाइल थे, जबकि एलए ने एचसी और बीएन की तुलना में महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाए। हमने सीरम चयापचयकों के दो सेटों की पहचान की जो एलए को एचसी और बीएन से अलग करते हैं।
सौम्य और घातक गांठों की पहचान के लिए वर्तमान एलडीसीटी-आधारित योजना मुख्य रूप से गांठों के आकार, घनत्व, आकृति विज्ञान और समय के साथ उनकी वृद्धि दर पर आधारित है।30 पिछले अध्ययनों से पता चला है कि गांठों का आकार फेफड़ों के कैंसर की संभावना से निकटता से संबंधित है। यहां तक ​​कि उच्च जोखिम वाले रोगियों में भी, 6 मिमी से छोटी गांठों में घातकता का जोखिम 1% से कम होता है। 6 से 20 मिमी आकार की गांठों में घातकता का जोखिम 8% से 64% तक होता है।30 इसलिए, फ्लेशनेर सोसाइटी नियमित सीटी फॉलो-अप के लिए 6 मिमी के कटऑफ व्यास की सिफारिश करती है।29 हालांकि, 6 मिमी से बड़ी अनिर्धारित फुफ्फुसीय गांठों (आईपीएन) के जोखिम मूल्यांकन और प्रबंधन को पर्याप्त रूप से नहीं किया गया है।31 जन्मजात हृदय रोग का वर्तमान प्रबंधन आमतौर पर बार-बार सीटी निगरानी के साथ सतर्क प्रतीक्षा पर आधारित होता है।
मान्य मेटाबोलोम के आधार पर, हमने पहली बार स्वस्थ व्यक्तियों और 6 मिमी से कम आकार की सौम्य गांठों के बीच मेटाबोलोमिक संकेतों के ओवरलैप को प्रदर्शित किया। जैविक समानता पिछले सीटी निष्कर्षों के अनुरूप है कि 6 मिमी से कम आकार की गांठों के लिए दुर्दमता का जोखिम उन व्यक्तियों के समान ही कम है जिनमें गांठें नहीं हैं।30 यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हमारे परिणाम यह भी दर्शाते हैं कि 6 मिमी से कम और 6 मिमी या उससे अधिक आकार की सौम्य गांठों में मेटाबोलोमिक प्रोफाइल में उच्च समानता है, जो यह सुझाव देता है कि सौम्य एटियलॉजी की कार्यात्मक परिभाषा गांठ के आकार की परवाह किए बिना सुसंगत है। इस प्रकार, आधुनिक नैदानिक ​​सीरम मेटाबोलाइट पैनल सीटी पर गांठों का प्रारंभिक पता चलने पर एक एकल परीक्षण के रूप में रोग-निवारक परीक्षण प्रदान कर सकते हैं और संभावित रूप से क्रमिक निगरानी को कम कर सकते हैं। साथ ही, मेटाबोलिक बायोमार्करों के उसी पैनल ने 6 मिमी या उससे अधिक आकार की घातक गांठों को सौम्य गांठों से अलग किया और सीटी छवियों पर समान आकार और अस्पष्ट रूपात्मक विशेषताओं वाले आईपीएन के लिए सटीक भविष्यवाणियां प्रदान कीं। सीरम मेटाबोलिज्म क्लासिफायर ने 6 मिमी या उससे बड़े नोड्यूल्स की घातकता का पूर्वानुमान लगाने में अच्छा प्रदर्शन किया, जिसका AUC 0.927 था। कुल मिलाकर, हमारे परिणाम बताते हैं कि विशिष्ट सीरम मेटाबोलॉमिक सिग्नेचर प्रारंभिक ट्यूमर-प्रेरित चयापचय परिवर्तनों को विशेष रूप से प्रतिबिंबित कर सकते हैं और नोड्यूल के आकार से स्वतंत्र रूप से जोखिम भविष्यवक्ता के रूप में संभावित मूल्य रखते हैं।
गौरतलब है कि फेफड़े का एडेनोकार्सिनोमा (LUAD) और स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (LUSC) नॉन-स्मॉल सेल लंग कैंसर (NSCLC) के मुख्य प्रकार हैं। यह देखते हुए कि LUSC का तंबाकू सेवन से गहरा संबंध है47 और CT स्कैन स्क्रीनिंग में पाए जाने वाले आकस्मिक फेफड़े के नोड्यूल्स में LUAD सबसे आम हिस्टोलॉजी है48, हमारा क्लासिफायर मॉडल विशेष रूप से स्टेज I एडेनोकार्सिनोमा के नमूनों के लिए बनाया गया था। वांग और उनके सहयोगियों ने भी LUAD पर ध्यान केंद्रित किया और लिपिडोमिक्स का उपयोग करके नौ लिपिड सिग्नेचर की पहचान की, जिससे प्रारंभिक चरण के फेफड़े के कैंसर को स्वस्थ व्यक्तियों से अलग किया जा सके17। हमने वर्तमान क्लासिफायर मॉडल का परीक्षण स्टेज I LUSC के 16 मामलों और 74 सौम्य नोड्यूल्स पर किया और LUSC की भविष्यवाणी की सटीकता कम पाई (AUC 0.776), जिससे पता चलता है कि LUAD और LUSC के अपने मेटाबोलॉमिक सिग्नेचर हो सकते हैं। वास्तव में, LUAD और LUSC के एटियलॉजी, जैविक उत्पत्ति और आनुवंशिक विकृतियों में अंतर पाया गया है49। इसलिए, स्क्रीनिंग कार्यक्रमों में फेफड़ों के कैंसर का जनसंख्या-आधारित पता लगाने के लिए प्रशिक्षण मॉडल में ऊतक विज्ञान के अन्य प्रकारों को भी शामिल किया जाना चाहिए।
यहां, हमने स्वस्थ व्यक्तियों और सौम्य गांठों की तुलना में फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा में सबसे अधिक परिवर्तित होने वाले छह मार्गों की पहचान की। ज़ैंथिन और हाइपोक्सैंथिन प्यूरीन चयापचय मार्ग के सामान्य मेटाबोलाइट्स हैं। हमारे परिणामों के अनुरूप, स्वस्थ व्यक्तियों या प्रीइनवेसिव चरण के रोगियों की तुलना में फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के रोगियों के सीरम या ऊतकों में प्यूरीन चयापचय से जुड़े मध्यवर्ती पदार्थों में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई।15,50 सीरम में ज़ैंथिन और हाइपोक्सैंथिन का बढ़ा हुआ स्तर तेजी से बढ़ने वाली कैंसर कोशिकाओं द्वारा आवश्यक एनाबोलिज्म को दर्शाता है। ग्लूकोज चयापचय का अविनियमन कैंसर चयापचय की एक सुप्रसिद्ध विशेषता है।51 यहां, हमने एचसी और बीएन समूह की तुलना में एलए समूह में पाइरूवेट और लैक्टेट में उल्लेखनीय वृद्धि देखी, जो गैर-छोटे सेल फेफड़े के कैंसर (एनएससीएलसी) के रोगियों और स्वस्थ व्यक्तियों के सीरम मेटाबोलोम प्रोफाइल में ग्लाइकोलिटिक मार्ग की असामान्यताओं की पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है। परिणाम सुसंगत हैं।52,53
महत्वपूर्ण बात यह है कि हमने फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के सीरम में पाइरुवेट और ट्रिप्टोफैन चयापचय के बीच विपरीत सहसंबंध देखा। एचसी या बीएन समूह की तुलना में एलए समूह में सीरम ट्रिप्टोफैन का स्तर कम था। दिलचस्प बात यह है कि एक पूर्व बड़े पैमाने के अध्ययन में, जिसमें एक भावी समूह का उपयोग किया गया था, पाया गया कि परिसंचारी ट्रिप्टोफैन के निम्न स्तर फेफड़े के कैंसर के बढ़ते जोखिम से जुड़े थे।54 ट्रिप्टोफैन एक आवश्यक अमीनो अम्ल है जो हमें पूरी तरह से भोजन से प्राप्त होता है। हम यह निष्कर्ष निकालते हैं कि फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा में सीरम ट्रिप्टोफैन की कमी इस मेटाबोलाइट की तीव्र कमी को दर्शा सकती है। यह सर्वविदित है कि किनुरेनाइन मार्ग के माध्यम से ट्रिप्टोफैन अपचय का अंतिम उत्पाद डी नोवो एनएडी+ संश्लेषण का स्रोत है। चूंकि एनएडी+ मुख्य रूप से साल्वेज मार्ग के माध्यम से उत्पादित होता है, इसलिए स्वास्थ्य और रोग में ट्रिप्टोफैन चयापचय में एनएडी+ का महत्व अभी निर्धारित किया जाना बाकी है।46 टीसीजीए डेटाबेस के हमारे विश्लेषण से पता चला कि सामान्य नियंत्रणों की तुलना में फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा में ट्रिप्टोफैन ट्रांसपोर्टर सॉल्यूट ट्रांसपोर्टर 7ए5 (एसएलसी7ए5) की अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी और यह ग्लाइकोलिटिक एंजाइम जीएपीडीएच की अभिव्यक्ति के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबंधित थी। पिछले अध्ययनों में मुख्य रूप से एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को दबाने में ट्रिप्टोफैन कैटाबोलिज्म की भूमिका पर ध्यान केंद्रित किया गया है40,41,42। यहां हम यह प्रदर्शित करते हैं कि फेफड़े के कैंसर कोशिकाओं में एसएलसी7ए5 के नॉकडाउन द्वारा ट्रिप्टोफैन अपटेक के अवरोध से कोशिकीय एनएडी स्तरों में बाद में कमी और ग्लाइकोलिटिक गतिविधि में एक साथ कमी आती है। संक्षेप में, हमारा अध्ययन फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के घातक परिवर्तन से जुड़े सीरम चयापचय में परिवर्तनों के लिए एक जैविक आधार प्रदान करता है।
NSCLC के रोगियों में EGFR उत्परिवर्तन सबसे आम प्रेरक उत्परिवर्तन हैं। हमारे अध्ययन में, हमने पाया कि EGFR उत्परिवर्तन वाले रोगियों (n = 41) का समग्र चयापचय प्रोफाइल जंगली-प्रकार के EGFR वाले रोगियों (n = 31) के समान था, हालांकि हमने कुछ EGFR उत्परिवर्ती रोगियों में एसिल्कार्नीटाइन के सीरम स्तर में कमी पाई। एसिल्कार्नीटाइन का स्थापित कार्य साइटोप्लाज्म से माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में एसिल समूहों का परिवहन करना है, जिससे वसा अम्लों का ऑक्सीकरण होकर ऊर्जा का उत्पादन होता है।55 हमारे निष्कर्षों के अनुरूप, एक हालिया अध्ययन ने 102 फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा ऊतक नमूनों के वैश्विक चयापचय का विश्लेषण करके EGFR उत्परिवर्ती और EGFR जंगली-प्रकार के ट्यूमर के बीच समान चयापचय प्रोफाइल की पहचान की।50 दिलचस्प बात यह है कि EGFR उत्परिवर्ती समूह में भी एसिल्कार्नीटाइन की मात्रा पाई गई। इसलिए, क्या एसिल्कार्नीटाइन के स्तर में परिवर्तन EGFR-प्रेरित चयापचय परिवर्तनों और अंतर्निहित आणविक मार्गों को दर्शाते हैं, इस पर आगे अध्ययन की आवश्यकता हो सकती है।
निष्कर्षतः, हमारा अध्ययन फुफ्फुसीय गांठों के विभेदक निदान के लिए एक सीरम चयापचय वर्गीकारक स्थापित करता है और एक कार्यप्रणाली का प्रस्ताव करता है जो सीटी स्कैन स्क्रीनिंग के आधार पर जोखिम मूल्यांकन को अनुकूलित कर सकता है और नैदानिक ​​प्रबंधन को सुगम बना सकता है।
इस अध्ययन को सन यात-सेन विश्वविद्यालय कैंसर अस्पताल, सन यात-सेन विश्वविद्यालय के प्रथम संबद्ध अस्पताल और झेंग्झोऊ विश्वविद्यालय कैंसर अस्पताल की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। खोज और आंतरिक सत्यापन समूहों में, सन यात-सेन विश्वविद्यालय कैंसर केंद्र के कैंसर नियंत्रण और रोकथाम विभाग में वार्षिक चिकित्सा जांच करा रहे स्वस्थ व्यक्तियों से 174 सीरम और सौम्य गांठों से 244 सीरम एकत्र किए गए, साथ ही सन यात-सेन विश्वविद्यालय कैंसर केंद्र से चरण I फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के 166 सौम्य गांठों के सीरम भी एकत्र किए गए। बाह्य सत्यापन समूह में, सन यात-सेन विश्वविद्यालय के प्रथम संबद्ध अस्पताल से सौम्य गांठों के 48 मामले, चरण I फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के 39 मामले और झेंग्झोऊ कैंसर अस्पताल से चरण I फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के 24 मामले शामिल थे। सन यात-सेन विश्वविद्यालय कैंसर केंद्र ने स्थापित मेटाबोलिक क्लासिफायर की नैदानिक ​​क्षमता का परीक्षण करने के लिए स्टेज I स्क्वैमस सेल फेफड़े के कैंसर के 16 मामले भी एकत्र किए (मरीज की विशेषताओं को अनुपूरक तालिका 5 में दर्शाया गया है)। खोज समूह और आंतरिक सत्यापन समूह के नमूने जनवरी 2018 से मई 2020 के बीच एकत्र किए गए थे। बाह्य सत्यापन समूह के नमूने अगस्त 2021 से अक्टूबर 2022 के बीच एकत्र किए गए थे। लिंग पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, प्रत्येक समूह में लगभग समान संख्या में पुरुष और महिला मामले शामिल किए गए थे। खोज दल और आंतरिक समीक्षा दल। प्रतिभागी का लिंग स्व-रिपोर्ट के आधार पर निर्धारित किया गया था। सभी प्रतिभागियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी और कोई मुआवजा नहीं दिया गया था। सौम्य गांठ वाले विषय वे थे जिनका विश्लेषण के समय 2 से 5 वर्षों में सीटी स्कैन स्कोर स्थिर था, बाह्य सत्यापन नमूने के 1 मामले को छोड़कर, जिसे ऑपरेशन से पहले एकत्र किया गया था और हिस्टोपैथोलॉजी द्वारा निदान किया गया था। क्रोनिक ब्रोंकाइटिस को छोड़कर। फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के मामलों को फेफड़े के रिसेक्शन से पहले एकत्र किया गया और पैथोलॉजिकल निदान द्वारा इसकी पुष्टि की गई। बिना किसी एंटीकोएगुलेंट के सीरम पृथक्करण ट्यूबों में खाली पेट रक्त के नमूने एकत्र किए गए। रक्त के नमूनों को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए जमने दिया गया और फिर सीरम सुपरनेटेंट को एकत्रित करने के लिए 4°C पर 10 मिनट के लिए 2851 × g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। मेटाबोलाइट निष्कर्षण तक सीरम के अंशों को -80°C पर जमा दिया गया। सन यात-सेन विश्वविद्यालय कैंसर केंद्र के कैंसर रोकथाम और चिकित्सा परीक्षण विभाग ने 40 से 55 वर्ष की आयु के समान संख्या में पुरुषों और महिलाओं सहित 100 स्वस्थ दाताओं से सीरम का एक पूल एकत्र किया। प्रत्येक दाता के नमूने की समान मात्रा को मिलाया गया, परिणामी पूल को अंशों में विभाजित किया गया और -80°C पर संग्रहित किया गया। सीरम मिश्रण का उपयोग गुणवत्ता नियंत्रण और डेटा मानकीकरण के लिए संदर्भ सामग्री के रूप में किया गया।
संदर्भ सीरम और परीक्षण नमूनों को पिघलाया गया और संयुक्त निष्कर्षण विधि (MTBE/मेथनॉल/पानी) 56 का उपयोग करके मेटाबोलाइट्स निकाले गए। संक्षेप में, 50 μl सीरम को 225 μl बर्फ-ठंडे मेथनॉल और 750 μl बर्फ-ठंडे मिथाइल टर्ट-ब्यूटाइल ईथर (MTBE) के साथ मिलाया गया। मिश्रण को हिलाया गया और 1 घंटे के लिए बर्फ पर रखा गया। फिर नमूनों को मिलाया गया और आंतरिक मानकों (13C-लैक्टेट, 13C3-पाइरुवेट, 13C-मेथियोनीन और 13C6-आइसोल्यूसीन, कैम्ब्रिज आइसोटोप लेबोरेटरीज से खरीदे गए) युक्त 188 μl MS-ग्रेड पानी के साथ वर्टेक्स मिश्रण किया गया। इसके बाद मिश्रण को 4°C पर 10 मिनट के लिए 15,000 × g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, और निचले चरण को सकारात्मक और नकारात्मक मोड में LC-MS विश्लेषण के लिए दो ट्यूबों (प्रत्येक 125 μL) में स्थानांतरित किया गया। अंत में, नमूने को उच्च गति वाले वैक्यूम कंसंट्रेटर में सुखाकर पूर्णतः वाष्पीकृत कर दिया गया।
शुष्क मेटाबोलाइट्स को 120 μl 80% एसीटोनिट्राइल में पुनर्गठित किया गया, 5 मिनट के लिए वर्टेक्स किया गया और 4°C पर 10 मिनट के लिए 15,000 × g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। मेटाबोलॉमिक्स अध्ययन के लिए सुपरनैटेंट को माइक्रोइंसर्ट वाले एम्बर ग्लास वायल में स्थानांतरित किया गया। अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-हाई-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UPLC-HRMS) प्लेटफॉर्म पर लक्षित मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण किया गया। मेटाबोलाइट्स को डायोनेक्स अल्टीमेट 3000 UPLC सिस्टम और एक्विटी बीईएच एमाइड कॉलम (2.1 × 100 मिमी, 1.7 μm, वाटर्स) का उपयोग करके अलग किया गया। पॉजिटिव आयन मोड में, मोबाइल चरण 95% (A) और 50% एसीटोनिट्राइल (B) थे, जिनमें से प्रत्येक में 10 mmol/L अमोनियम एसीटेट और 0.1% फॉर्मिक एसिड था। नेगेटिव मोड में, मोबाइल फेज़ A और B में क्रमशः 95% और 50% एसीटोनिट्राइल था, दोनों फेज़ में 10 mmol/L अमोनियम एसीटेट था, pH = 9। ग्रेडिएंट प्रोग्राम इस प्रकार था: 0–0.5 मिनट, 2% B; 0.5–12 मिनट, 2–50% B; 12–14 मिनट, 50–98% B; 14–16 मिनट, 98% B; 16–16.1 मिनट, 98–2% B; 16.1–20 मिनट, 2% B। ऑटोसेम्प्लर में कॉलम को 40°C और सैंपल को 10°C पर रखा गया था। प्रवाह दर 0.3 मिली/मिनट थी, इंजेक्शन की मात्रा 3 μl थी। इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI) स्रोत से युक्त Q-Exactive Orbitrap मास स्पेक्ट्रोमीटर (Thermo Fisher Scientific) को फुल स्कैन मोड में संचालित किया गया और बड़ी मात्रा में डेटा एकत्र करने के लिए इसे ddMS2 मॉनिटरिंग मोड के साथ जोड़ा गया। MS पैरामीटर इस प्रकार सेट किए गए थे: स्प्रे वोल्टेज +3.8 kV/- 3.2 kV, केशिका तापमान 320°C, परिरक्षण गैस 40 arb, सहायक गैस 10 arb, प्रोब हीटर तापमान 350°C, स्कैनिंग रेंज 70–1050 m/h, रिज़ॉल्यूशन 70,000। डेटा Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) का उपयोग करके प्राप्त किया गया था।
डेटा की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, प्रत्येक नमूने से सुपरनेटेंट के 10 μL अंश निकालकर पूल्ड क्वालिटी कंट्रोल (QC) नमूने तैयार किए गए। UPLC-MS प्रणाली की स्थिरता का आकलन करने के लिए विश्लेषणात्मक अनुक्रम की शुरुआत में छह क्वालिटी कंट्रोल नमूना इंजेक्शनों का विश्लेषण किया गया। इसके बाद, बैच में समय-समय पर क्वालिटी कंट्रोल नमूने शामिल किए जाते हैं। इस अध्ययन में सीरम नमूनों के सभी 11 बैचों का विश्लेषण LC-MS द्वारा किया गया। निष्कर्षण प्रक्रिया की निगरानी करने और बैच-दर-बैच प्रभावों को समायोजित करने के लिए, 100 स्वस्थ दाताओं से प्राप्त सीरम पूल मिश्रण के अंशों को संबंधित बैचों में संदर्भ सामग्री के रूप में उपयोग किया गया। डिस्कवरी कोहोर्ट, आंतरिक सत्यापन कोहोर्ट और बाहरी सत्यापन कोहोर्ट का अनटारगेटेड मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण सन यात-सेन विश्वविद्यालय के मेटाबोलॉमिक्स केंद्र में किया गया। ग्वांगडोंग प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय विश्लेषण और परीक्षण केंद्र की बाहरी प्रयोगशाला ने भी क्लासिफायर मॉडल के प्रदर्शन का परीक्षण करने के लिए बाहरी कोहोर्ट से 40 नमूनों का विश्लेषण किया।
निष्कर्षण और पुनर्निर्माण के बाद, सीरम मेटाबोलाइट्स की पूर्ण मात्रा का निर्धारण अल्ट्रा-हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एजिलेंट 6495 ट्रिपल क्वाड्रुपोल) का उपयोग करके मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग (एमआरएम) मोड में इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) स्रोत के साथ किया गया। मेटाबोलाइट्स को अलग करने के लिए एक एक्विटी बीईएच एमाइड कॉलम (2.1 × 100 मिमी, 1.7 μm, वाटर्स) का उपयोग किया गया। मोबाइल चरण में 90% (ए) और 5% एसीटोनिट्राइल (बी) के साथ 10 मिमी मोल/लीटर अमोनियम एसीटेट और 0.1% अमोनिया घोल शामिल था। ग्रेडिएंट प्रोग्राम इस प्रकार था: 0–1.5 मिनट, 0% बी; 1.5–6.5 मिनट, 0–15% बी; 6.5–8 मिनट, 15% बी; 8–8.5 मिनट, 15%–0% बी; 8.5–11.5 मिनट, 0%B। ऑटोसेम्प्लर में कॉलम को 40 °C और नमूने को 10 °C पर बनाए रखा गया था। प्रवाह दर 0.3 मिलीलीटर/मिनट और इंजेक्शन की मात्रा 1 μL थी। एमएस पैरामीटर इस प्रकार सेट किए गए थे: केशिका वोल्टेज ±3.5 kV, नेबुलाइज़र दबाव 35 psi, शीथ गैस प्रवाह 12 लीटर/मिनट, शीथ गैस तापमान 350°C, सुखाने वाली गैस का तापमान 250°C और सुखाने वाली गैस का प्रवाह 14 लीटर/मिनट। ट्रिप्टोफैन, पाइरुवेट, लैक्टेट, हाइपोक्सैंथिन और ज़ैंथिन के एमआरएम रूपांतरण क्रमशः 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 और 151.0–107.9 थे। डेटा को मास हंटर बी.07.00 (एजिलेंट टेक्नोलॉजीज) का उपयोग करके एकत्र किया गया था। सीरम नमूनों के लिए, ट्रिप्टोफैन, पाइरुवेट, लैक्टेट, हाइपोक्सैंथिन और ज़ैंथिन की मात्रा को मानक मिश्रण विलयनों के अंशांकन वक्रों का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। कोशिका नमूनों के लिए, ट्रिप्टोफैन की मात्रा को आंतरिक मानक और कोशिका प्रोटीन द्रव्यमान के सापेक्ष सामान्यीकृत किया गया था।
पीक निष्कर्षण (m/z और प्रतिधारण समय (RT)) कंपाउंड डिस्कवरी 3.1 और ट्रेसफाइंडर 4.0 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके किया गया था। बैचों के बीच संभावित अंतरों को दूर करने के लिए, परीक्षण नमूने के प्रत्येक विशिष्ट शिखर को उसी बैच के संदर्भ पदार्थ के विशिष्ट शिखर से विभाजित करके सापेक्ष प्रचुरता प्राप्त की गई। मानकीकरण से पहले और बाद में आंतरिक मानकों के सापेक्ष मानक विचलन अनुपूरक तालिका 6 में दर्शाए गए हैं। दोनों समूहों के बीच अंतर को झूठी खोज दर (FDR<0.05, विलकॉक्सन साइन्ड रैंक टेस्ट) और फोल्ड परिवर्तन (>1.2 या <0.83) द्वारा दर्शाया गया था। निकाले गए विशेषताओं का कच्चा MS डेटा और संदर्भ सीरम-संशोधित MS डेटा क्रमशः अनुपूरक डेटा 1 और अनुपूरक डेटा 2 में दर्शाया गया है। पीक एनोटेशन पहचान के चार परिभाषित स्तरों के आधार पर किया गया था, जिसमें पहचाने गए मेटाबोलाइट्स, संभावित रूप से एनोटेटेड यौगिक, संभावित रूप से विशेषता वाले यौगिक वर्ग और अज्ञात यौगिक 22 शामिल हैं। कंपाउंड डिस्कवरी 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) में डेटाबेस खोजों के आधार पर, mzCloud (स्कोर > 85) या Chemspider में मान्य मानकों से मेल खाने वाले MS/MS मिलान वाले या सटीक मिलान एनोटेशन वाले जैविक यौगिकों को अंततः विभेदक मेटाबोलोम के मध्यवर्ती के रूप में चुना गया। प्रत्येक विशेषता के लिए पीक एनोटेशन पूरक डेटा 3 में शामिल हैं। मेटाबोएनालिस्ट 5.0 का उपयोग योग-सामान्यीकृत मेटाबोलाइट प्रचुरता के एकतरफ़ा विश्लेषण के लिए किया गया था। मेटाबोएनालिस्ट 5.0 ने महत्वपूर्ण रूप से भिन्न मेटाबोलाइट्स के आधार पर KEGG पाथवे संवर्धन विश्लेषण का भी मूल्यांकन किया। स्टैक नॉर्मलाइज़ेशन और ऑटोस्केलिंग के साथ ropls सॉफ़्टवेयर पैकेज (v.1.26.4) का उपयोग करके प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस (PCA) और पार्शियल लीस्ट स्क्वेयर्स डिस्क्रिमिनेंट एनालिसिस (PLS-DA) का विश्लेषण किया गया। नोड्यूल की दुर्दमता का पूर्वानुमान लगाने के लिए इष्टतम मेटाबोलाइट बायोमार्कर मॉडल को लीस्ट एब्सोल्यूट श्रिंकेज एंड सिलेक्शन ऑपरेटर (LASSO, R पैकेज v.4.1-3) के साथ बाइनरी लॉजिस्टिक रिग्रेशन का उपयोग करके तैयार किया गया था। डिटेक्शन और वैलिडेशन सेट में डिस्क्रिमिनेंट मॉडल के प्रदर्शन को pROC पैकेज (v.1.18.0) के अनुसार ROC विश्लेषण के आधार पर AUC का अनुमान लगाकर निर्धारित किया गया था। इष्टतम संभाव्यता कटऑफ मॉडल के अधिकतम यूडेन इंडेक्स (संवेदनशीलता + विशिष्टता – 1) के आधार पर प्राप्त किया गया था। थ्रेशोल्ड से कम या अधिक मान वाले नमूनों को क्रमशः सौम्य नोड्यूल और फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा के रूप में पूर्वानुमानित किया जाएगा।
A549 कोशिकाओं (#CCL-185, अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन) को 10% FBS युक्त F-12K माध्यम में विकसित किया गया। SLC7A5 को लक्षित करने वाले लघु हेयरपिन RNA (shRNA) अनुक्रमों और एक गैर-लक्षित नियंत्रण (NC) को लेंटिवाइरल वेक्टर pLKO.1-puro में डाला गया। shSLC7A5 के प्रतिसंवेदी अनुक्रम इस प्रकार हैं: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′)। SLC7A5 (#5347) और ट्यूबलिन (#2148) के एंटीबॉडी सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी से खरीदे गए। वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण के लिए SLC7A5 और ट्यूबलिन के एंटीबॉडी का उपयोग 1:1000 के तनुकरण पर किया गया।
सीहॉर्स एक्सएफ ग्लाइकोलिटिक स्ट्रेस टेस्ट बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण (ईसीआर) के स्तर को मापता है। इस परीक्षण में, ग्लूकोज, ओलिगोमाइसिन ए और 2-डीजी को क्रमिक रूप से दिया गया ताकि ईसीआर द्वारा मापी गई कोशिकीय ग्लाइकोलिटिक क्षमता का परीक्षण किया जा सके।
नॉन-टारगेटिंग कंट्रोल (NC) और shSLC7A5 (Sh1, Sh2) से ट्रांसफेक्टेड A549 कोशिकाओं को 10 सेमी व्यास वाली डिश में रात भर के लिए रखा गया। कोशिका मेटाबोलाइट्स को 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे 80% जलीय मेथनॉल से निकाला गया। मेथनॉल घोल में मौजूद कोशिकाओं को खुरचकर एक नई ट्यूब में इकट्ठा किया गया और 4°C पर 15 मिनट के लिए 15,000 × g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। 800 µl सुपरनेटेंट को इकट्ठा करके हाई-स्पीड वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करके सुखाया गया। सूखे मेटाबोलाइट पेलेट्स में ट्रिप्टोफैन के स्तर का विश्लेषण ऊपर वर्णित विधि के अनुसार LC-MS/MS का उपयोग करके किया गया। A549 कोशिकाओं (NC और shSLC7A5) में कोशिकीय NAD(H) के स्तर को निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक मात्रात्मक NAD+/NADH कैलोरीमेट्रिक किट (#K337, BioVision) का उपयोग करके मापा गया। मेटाबोलाइट्स की मात्रा को सामान्य करने के लिए प्रत्येक नमूने में प्रोटीन के स्तर को मापा गया।
नमूने के आकार को प्रारंभिक रूप से निर्धारित करने के लिए किसी भी सांख्यिकीय विधि का उपयोग नहीं किया गया था। बायोमार्कर की खोज के उद्देश्य से किए गए पिछले मेटाबोलॉमिक्स अध्ययनों15,18 को आकार निर्धारण के लिए मानक माना गया है, और इन रिपोर्टों की तुलना में, हमारा नमूना पर्याप्त था। अध्ययन समूह से कोई भी नमूना बाहर नहीं किया गया था। लक्षित मेटाबोलॉमिक्स अध्ययनों के लिए सीरम नमूनों को यादृच्छिक रूप से एक खोज समूह (306 मामले, 74.6%) और एक आंतरिक सत्यापन समूह (104 मामले, 25.4%) में विभाजित किया गया था। लक्षित मेटाबोलॉमिक्स अध्ययनों के लिए हमने खोज समूह से प्रत्येक समूह से 70 मामले यादृच्छिक रूप से चुने। LC-MS डेटा संग्रह और विश्लेषण के दौरान शोधकर्ताओं को समूह आवंटन के बारे में जानकारी नहीं दी गई थी। मेटाबोलॉमिक्स डेटा और कोशिका प्रयोगों के सांख्यिकीय विश्लेषण का वर्णन संबंधित परिणाम, चित्र विवरण और विधियाँ अनुभागों में किया गया है। कोशिकीय ट्रिप्टोफैन, NADT और ग्लाइकोलिटिक गतिविधि का मात्रात्मक विश्लेषण तीन बार स्वतंत्र रूप से किया गया और परिणाम समान रहे।
अध्ययन के स्वरूप के बारे में अधिक जानकारी के लिए, इस लेख से संबंधित नेचुरल पोर्टफोलियो रिपोर्ट का सारांश देखें।
निकाले गए फ़ीचर्स का रॉ एमएस डेटा और संदर्भ सीरम का नॉर्मलाइज़्ड एमएस डेटा क्रमशः सप्लीमेंट्री डेटा 1 और सप्लीमेंट्री डेटा 2 में दिखाया गया है। डिफरेंशियल फ़ीचर्स के लिए पीक एनोटेशन सप्लीमेंट्री डेटा 3 में प्रस्तुत किए गए हैं। LUAD TCGA डेटासेट https://portal.gdc.cancer.gov/ से डाउनलोड किया जा सकता है। ग्राफ़ बनाने के लिए इनपुट डेटा सोर्स डेटा में दिया गया है। इस लेख के लिए सोर्स डेटा उपलब्ध कराया गया है।
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